We beschrijven een dramatisch verbeterde methode voor het klonen van de muis met trichostatin A, vitamine C en gedeïoniseerd bovien serumalbumine. Laten we een vereenvoudigde, reproduceerbare protocol dat efficiënte ontwikkeling van gekloonde embryo’s wordt ondersteund. Vandaar, zou deze methode worden een gestandaardiseerde procedure voor het klonen van de muis.
Aantal somatische cellen nucleaire overdracht (SCNT) biedt een unieke gelegenheid om rechtstreeks produceren een gekloonde dier uit een cel van de donor, en het vereist het gebruik van bekwame technieken. Bovendien hebben de efficiëntie van het klonen bleven laag sinds de succesvolle productie van gekloonde dieren, vooral muizen. Er zijn vele pogingen ter verbetering van de kloneringsefficiëntie en trichostatin A (TSA), een histone deacetylase inhibitor, is wijd verbeid gebruikt ter verbetering van de efficiëntie van klonen. Wij rapporteren hier een drastisch verbeterde klonen methode in muizen. Dit aantal somatische cellen nucleaire overzetmethode omvat zede van Hemagglutinating virus van Japan envelop (HVJ-E), waardoor gemakkelijke manipulatie. Bovendien is de behandeling met behulp van twee kleine molecules, TSA en vitamine C (VC), met gedeïoniseerd bovien serumalbumine (dBSA), is zeer effectief voor embryonale ontwikkeling. Deze aanpak vereist extra injectie noch genetische manipulatie, en dus presenteert een eenvoudige, geschikte methode voor praktisch gebruik. Deze methode zou kunnen worden een technisch haalbaar aanpak voor onderzoekers voor de productie van genetisch gemodificeerde dieren uit gekweekte cellen. Bovendien zou het een nuttige manier voor de redding van bedreigde diersoorten via klonen.
De SCNT-technologie maakt de productie van gekloonde dieren met behulp van slechts een aantal somatische cellen of een kern worden overgebracht naar een enucleated oöcyt. Een van de doeleinden van de SCNT-techniek is de afleiding van nucleaire embryonale stamcellen (NT-SER’s) de transferregels van gekloonde embryo’s. In 1998, Wakayama et al.., gerapporteerde produceren een succesvol gekloonde muis genaamd Cumulina voor de eerste keer1. Sindsdien is het klonen van muizen grote schaal is onderzocht, en vele belangrijke inzichten in nucleaire herprogrammering van somatische kernen zijn verkregen. Aan de andere kant, deze techniek gaat gepaard met talrijke micromanipulation stappen die heel moeilijk te meester, intensieve training van meer dan 3 maanden2vereisen.
Productie van gekloonde muizen met behulp van SCNT geëvolueerd van de oorspronkelijke Honolulu methode1, de electrofusion methode3, aan de methode cell fusion door Hemagglutinating virus van Japan (HVJ)4. Echter, de directe inspuiting van de kern van een cel door de cytomembrane neiging om leefbaarheid van invloed zijn op overleving van de oöcyt. De electrofusion is laag in efficiëntie, aangezien elke celmembraan verschillende hardheid heeft, waardoor het moeilijk is om een optimale conditie. De behandeling van het HVJ is moeizaam want het vergt specifieke apparatuur voor de veiligheid van onderzoekers en proefdieren. Om te smelten het donor-cel en oöcyt cytoplasma, HVJ-E heeft onlangs gebruikte5. HVJ-E heeft slechts de mogelijkheid om te fuseren membranen zonder de mogelijkheid van het proliferatieve of besmettelijke virussen. Genomic RNAs van HVJ zijn volledig geïnactiveerd in HVJ-E. Het gebruik van HVJ-E ondersteunt dus gemakkelijk te hanteren van celfusie tijdens SCNT.
Verschillende rapporten is gebleken dat de behandeling van SCNT embryo’s met TSA, een histone deacetylase inhibitor, aanzienlijk de productieefficiency van levende pups van minder dan 1% tot 6.5%6,7 verbetert. TSA behandeling versnelt herprogrammering door Histon merken in SCNT embryo’s8wijzigen. Onlangs, injectie van bepaalde mRNAs, de Histon lysine demethylase onderfamilie 4 (KDM4), waarvan Histon H3 lysine 9 (H3K9 verwijderen) trimethylation in SCNT embryo’s, met name op reprograming-resistente gebieden, is aangetoond dat het verhogen van de ontwikkeling van gekloonde muis embryo’s9. Ondertussen, is VC, die ook als een Histon modifier fungeert, trimethylation van H3K910afgenomen. Bovendien verhoogt VC embryonale ontwikkeling in varkens SCNT10. Er werd gemeld dat de injectie van dBSA in SCNT embryo’s tot verbetering van de embryonale ontwikkeling11 leidt.
Eerder vonden we dat de combinatie van kleine molecules, namelijk TSA en VC, samen met dBSA, ontwikkeling van SCNT embryo’s12dramatisch verbeterd. Hier, detail we de eerder gemelde SCNT methode voor muizen, waarmee zeer efficiënte en eenvoudige klonen procedures-12. Ook beschrijven we de behandeling van HVJ-E. Deze kon vele onderzoekers op het gebied van ontwikkelings- en reproductieve biologie aan het behoud van genetische hulpbronnen of genetisch gemodificeerde dieren produceren door middel van deze methode SCNT helpen.
Kortom, suggereren deze resultaten dat de onderhavige SCNT-methode kan verminderen van technische problemen, en verhoging van de efficiëntie van SCNT zonder genetische modificaties en mRNA suppletie (tabel 1, tabel 2), en zorgen stabiele productie van gekloonde embryo’s. Deze methode ons in staat stelt om te reconstrueren meer SCNT-embryo’s dan conventionele methoden als gevolg van de betere overlevingskans en vereenvoudigde protocol. In dit protocol is een essentiële stap celfusie. Succesvol produceren gekloonde muizen, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid HVJ-E beschreven in het protocol wordt gehandhaafd tijdens de fusie cel en eicellen moeten worden teruggegeven aan de incubator binnen 10 min tijdens de stappen 6.2.3 – 6.2.5. Aangezien 20 tot 30 donor cellen kunnen worden aanzuiging samen met HVJ-E op een moment in de pipet manipulatie, is het aantal eicellen verkregen door één bewerking groter dan die van de bestaande methode. Uiteindelijk kunnen wij produceren ongeveer 20 tot 30 opnieuw gebouwd eicellen binnen 10 min. Zelfs wanneer u werkt met een grote partij van eicellen (100 of meer), de cel fusion procedure moet nemen een uur of minder door de stappen 6.2.3 – 6.2.5 te herhalen. De methode en de technieken die hier gepresenteerd kunnen dienen als efficiënt protocollen met vereenvoudigde technische voorschriften.
De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van SCNT embryo’s zijn momenteel nog onduidelijk. Deze verbeterde SCNT-methode draagt ook bij aan het bestuderen van deze herprogrammering mechanismen, aangezien deze methode veel gekloonde embryo’s in slechts één experiment kan opleveren. Deze methode maakt gebruik van somatische cellen met intact celmembranen voor celfusie. Aldus, kan het mogelijk zijn deze benadering toepassen op andere cellen zoals staart tip16cellen, sertoli17 cellenjp18van de cellen van de embryonale stamcellen (ES). Wanneer conventionele SCNT-methoden worden gebruikt voor het injecteren van relatief grote cellen, zoals staart tip cellen, rechtstreeks in het cytoplasma van de oöcyt wordt zelfs meer technisch veeleisende om levende embryo’s. Bovendien zijn relatief harde cellen, zoals de sertoli-cellen, moeilijk te breken door pipetteren voor het injecteren. Wanneer deze verschillende celtypes worden beschouwd, wordt de cel fusion methode met behulp van HVJ-E is eenvoudig en effectief. Hoewel de waarde en veiligheid van HVJ-E hebben overtuigend aangetoond dat19,20, is het wellicht belangrijk te heroverwegen de haalbaarheid van het gebruik van HVJ-E voor het produceren van gekloonde dieren voor landbouw of biomedische doeleinden.
Bovendien onlangs een groep met succes geproduceerd gekloonde muizen afgeleid van urine cellen21. Om te redden van bedreigde soorten zoogdieren, voortaan SCNT de cuvetten verzameld in een niet-invasieve wijze, zoals de cel van de urine, ideaal. Meer recentelijk, een andere groep heeft direct gegenereerd gekloonde muizen met antigeen-specifieke CD4+ T cellen22. Het zou interessant zijn om te onderzoeken of deze methode ook geldt voor het efficiënt kloon muizen van dergelijke cellen. Latrunculin A heeft bovendien als een beter alternatief voor de remming van de polymerisatie van actine tijdens enucleation en ongeslachtelijke activering van SCNT eicellen23gemeld. Toekomstige studie kan onthullen of de behandeling van de Latrunculin A, in plaats van cytochalasin B, generatie nakomelingen van gekloonde verder verbetert. Bovendien, is de TSA behandeling met succes gebruikt in muizen, varkens24jp25 van de konijnen door het veranderen van de behandeltijd, periode en concentratie. Bovendien, VC verhoogt embryonale ontwikkeling in varkens SCNT10, maar verbetert ook iPS celproductie bij mensen en muizen26. Het is dus aannemelijk om te speculeren dat TSA en VC behandeling kan ook worden toegepast op andere soorten zoogdieren, en wij kunnen moeten optimaliseren de behandeltijd van TSA en VC voor elke soort.
Kortom, zou deze methode het mogelijk maken voor het genereren van de gekloonde muizen met een praktische niveau van efficiëntie met eenvoudige procedures. Dus, de resultaten van deze studie kunnen leiden wij de SCNT-technologie gebruiken voor het behoud van de genetische hulpbronnen van de zeldzame dieren en voor het begrip van de moleculaire mechanismen van nucleaire herprogrammering en de vroege embryonale ontwikkeling.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI subsidie nummers JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 tot K.M. Sumitomo verlenen van de Stichting voor fundamenteel onderzoeksprojecten van de wetenschap (150810 aan K.M.). Kindai Universiteit onderzoeksbeurs (15-I-2 K.M. en M.A.). M.O. erkentelijk voor de steun van de kern geboden door Cancer Research UK (C6946/A24843) en de Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Wij danken mevrouw N. Backes-Kamimura en Mr. J. Horvat voor bewijs lezen.
NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |