Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Het celmembraan van eukaryotische cellen bestaat uit een dubbele laag van eiwit-studded fosfolipiden die definieert het intra/extracellulaire milieu van de cel en is essentieel voor het behoud van cellulaire homeostase en cel overleven. Celmembraan verwondingen als gevolg van mechanische of chemische beledigingen zijn gemeengoed in verschillende zoogdieren celtypen, met inbegrip van skelet en hartspier, maag en longen cellen^1,2,3,4. Naast Blessures gevolg van dagelijkse fysiologische functie, kunnen celmembranen ook worden beschadigd door milieu beledigingen, bacteriële toxines en ischemische reperfusie⁵. Niet verzegelen van breuken in de celmembraan leidt tot een ongecontroleerde toestroom van extracellulaire Ca^{2 +}– samen met andere potentieel giftige componenten van de extracellulaire – in de cel, triggering stroomafwaarts signaal cascades die snel in cel resulteren kunnen dood^1,4,5,6.

Tot op heden, zijn er verschillende voorgestelde modellen voor membraan reparatie in cellen. Verschillende herstelmechanismes kunnen worden geactiveerd afhankelijk van de grootte en de aard van de breuk van het membraan. Bijvoorbeeld, wordt voorgesteld dat celmembranen gebruik maken van kan laterale stroom of eiwit verstopping om te herstellen van kleine verstoringen (< 1 nm). De laterale fusion-model stelt dat membraan breuken zijn snel mended via laterale aanwerving van dysferlin-bevattende membraan⁷, terwijl het eiwit verstopping model suggereert dat kleine perforaties via eiwit aggregaties zijn mended (meestal annexins) ⁸. omgekeerd, grotere membraan laesies leiden tot Ca^{2 +}-afhankelijk, dysferlin-gemedieerde vesikel kernversmelting en de vorming van een reparatie patch. In de reparatie patch model, een snelle Ca^{2 +} toestroom in de cel activeert de aanwerving van meerdere eiwitten (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 en EDH eiwitten) die een complex of “patch”, samen met een fusie van intracellulaire vesikels vormen of Lysosomen op de site van membraan beschadigen^4,9,10,11,12. Het is belangrijk op te merken dat deze modellen elkaar niet noodzakelijkerwijs uitsluiten en in concert werken kunnen om reparatie van de membraan. Niet goed verzegelen celmembraan schade is gekoppeld aan meerdere ziekte staten, met inbegrip van spierdystrofie (dysferlinopathy – met inbegrip van Miyoshi myopathie, limb-girdle spierdystrofie type IIB en distale myopathie met anterior tibiale begin) ¹³, cardiomyopathie¹⁴, en Chediak-Higashi syndroom (CHS)¹⁵.

Gezien de juiste cel membraan integriteit en opnieuw verzegelen speelt zo’n belangrijke rol in gezondheid en ziekte, een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van celmembraan reparatie gunstig zou zijn in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën. Het is daarom noodzakelijk te beschikken over passende experimentele technieken om te controleren de kinetiek en evalueren van het vermogen van de celmembraan reparatie. Verscheidene in vitro methoden voor de modellering van de reparatie van de membraan zijn ontworpen. Een strategie gaat om mechanische schade, die kan worden vergemakkelijkt door de cel schrapen met een pipet/chirurgisch mes/scheermes of door glaskralen kantelen de cellen¹⁶. Echter dit soort mechanische schade grotere laesies genereert en creëert een hoge mate van variatie in cel letsel, zowel binnen als tussen culturen.

Een andere methode voor de opwekking van membraan wonden is laser ablatie door twee-foton microscopie. In tegenstelling tot traditionele laser confocal microscopie die gebruikmaakt van één foton excitatie, gebruikt de laser twee-foton gelijktijdig twee lange golflengte, lage-energie fotonen ter vergemakkelijking van de excitatie van een hoog-energetische elektronen¹⁷. Dit niet-lineaire proces resulteert in excitatie uitsluitend binnen het brandvlak en niet langs de gehele lichtpad¹⁷ (Figuur 1). Dit verminderde excitatie volume helpt bij het minimaliseren van photodamage wanneer imaging levende cellen^18,19. Daarom zijn onderzoekers kunnen produceren nauwkeurige laesies in de celmembraan en monitor membraan opnieuw verzegelen in real-time met behulp van fluorescente kleurstoffen en observeren van wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie als de celmembraan breuken en vervolgens verzegelingen.

Deze aanpak is herhaaldelijk gebruikt om studeren membraan verwonding in vitro jp in vivo en in meerdere cel typen^20,21. Bijvoorbeeld membraan herstellen gebreken in fibroblasten en myotubes afgeleid van dysferlinopathy patiënten werden beoordeeld met behulp van deze techniek^22,23. Ook werden enkele spiervezels geïsoleerd van muizen gebruikt om de reparatie patch vorming^13,24,25te controleren. De beweging van fluorescently tagged eiwitten kan ook worden waargenomen tijdens membraan reparatie in enkele spiervezels⁹. Bovendien, het proces van sarcolemmal reparatie na twee-foton laser verwonding in zebrafish embryo’s kan worden waargenomen in real-time in vivo²⁶.

In dit artikel duidelijk naar voren komt een methodologie voor de beoordeling van de dynamiek van de reparatie van de celmembraan in fibroblasten met behulp van twee-foton laser verwonden, hoewel deze methode kan worden toegepast op verschillende celtypen, met het oog op het kwantificeren van plasmamembraan opnieuw verzegelen van vermogen in vitro. Bij deze methode worden de cellen geïncubeerd met FM4-64, een lipofiele, cel-ondoordringbare kleurstof die snel licht als het bindt aan negatief geladen fosfolipiden in het cytoplasma bij binnenkomst in de cel door de membraan-laesie (Figuur 2& 3). kwantificering van kleurstof fluorescentie grenzend aan de laesie membraan zorgt voor controle van de tijd die nodig is voor de celmembraan te verzegelen zelf. Om te illustreren het nut van deze methode, gebruiken we dysferlinopathy patiënt fibroblasten transfected met plasmiden GFP-geconjugeerde full-length dysferlin (DYSF) te beoordelen van de redding van de celmembraan reparatie.