Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células^1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser danificadas por insultos ambientais, toxinas bacterianas e reperfusão isquêmica⁵. Falha de selar rupturas na membrana celular leva ao influxo não regulamentado de extracelular Ca^{2 +}– juntamente com outros componentes extracelulares potencialmente tóxicos – dentro da célula, desencadeando cascatas de sinal a jusante que rapidamente podem resultar em células morte^1,4,5,6.

Até à data, tem havido vários modelos propostos para o reparo de membrana nas células. Mecanismos de reparação diferentes podem ser ativados, dependendo do tamanho e da natureza da ruptura da membrana. Por exemplo, sugere-se que as membranas celulares podem utilizar fluxo lateral ou proteína entupimento para reparar pequenas interrupções (< 1 nm). O modelo de fusão lateral propõe que rupturas de membrana são rapidamente reparadas através de recrutamento lateral de dysferlin contendo membrana⁷, enquanto a proteína entupimento modelo sugere que pequenas perfurações são remendadas através de agregações de proteínas (principalmente anexinas) ⁸. Inversamente, desencadear lesões maiores de membrana Ca^{2 +}-dependente, mediada por dysferlin vesículas fusão e formação de um remendo do reparo. No modelo de remendo de reparação, um rápida Ca^{2 +} influxo para a célula dispara o recrutamento de várias proteínas (dysferlin, anixinas, mitsugumin-53 e proteínas EDH) que formam um complexo ou “patch”, juntamente com uma fusão de vesículas intracelulares ou lisossomos no local da membrana danificar^4,9,10,11,12. É importante notar que estes modelos não são necessariamente mutuamente exclusivos e podem trabalhar em conjunto para facilitar a reparação da membrana. Falha de selar corretamente o dano da membrana celular está associada a vários Estados da doença, incluindo distrofia muscular (dysferlinopathy – incluindo Miyoshi miopatia, membro-cinta distrofia muscular tipo IIB e miopatia distal com início tibial anterior) ¹³, cardiomiopatia¹⁴e Chediak-Higashi síndrome (CHS)¹⁵.

Dada essa integridade adequada da membrana celular e peças de fechamento um papel tão importante na saúde e na doença, uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes do reparo da membrana celular seria benéfica na busca de novas estratégias terapêuticas. É, portanto, necessário possuir técnicas experimentais adequadas para a cinética de monitorar e avaliar a capacidade de reparação da membrana celular. Vários métodos em vitro para reparação de membrana de modelagem foram projetados. Uma estratégia envolve lesão mecânica, que pode ser facilitado através da célula a raspar com uma lâmina/navalha pipeta/cirúrgico ou pelo rolamento esferas de vidro sobre as células de¹⁶. No entanto, este tipo de lesão mecânica gera lesões maiores e cria um elevado grau de variação no ferimento da pilha, tanto dentro como entre culturas.

Outro método de gerar feridas de membrana é ablação a laser por microscopia de dois fotões. Em contraste com a microscopia confocal laser tradicional que emprega a excitação de fóton único, o laser de dois fotões usa simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longa, baixo consumo de energia para facilitar a excitação de um elétron de alta energia¹⁷. Este processo não-linear resulta em excitação exclusivamente dentro do plano focal e não ao longo do trajeto da luz toda¹⁷ (Figura 1). Este reduzido excitação volume ajuda a minimizar Fotodano quando de imagens ao vivo de células^18,19. Pesquisadores, portanto, são capazes de gerar lesões precisas na membrana celular e monitor membrana efectuou em tempo real usando corantes fluorescentes e observar as alterações da intensidade de fluorescência como a ruptura da membrana celular e, depois, regenere.

Esta abordagem tem sido usada repetidamente para estudar a membrana ferindo em vitro e em vivo e em célula de vários tipos de^20,21. Por exemplo, a membrana reparar defeitos em fibroblastos e myotubes derivado de dysferlinopathy, os pacientes foram avaliados utilizando esta técnica^22,23. Também, única fibras musculares isoladas de ratos foram usadas para monitorar reparo remendo formação^13,24,25. O movimento de proteínas fluorescente etiquetados também pode ser observado durante o reparo da membrana em fibras de músculo único⁹. Além disso, o processo de reparação mecanismos a seguir dois fotões laser ferindo em embriões de peixe-zebra pode ser observado em tempo real na vivo²⁶.

Neste artigo, descrevem uma metodologia para avaliar a dinâmica de reparo da membrana celular em fibroblastos usando dois fotões laser ferindo, embora esta metodologia pode ser aplicada a vários tipos de células com a finalidade de quantificar a membrana plasmática, capacidade de fechamento em vitro. Neste método, as células são incubadas com FM4-64, um corante lipofílico, célula-impermeável que fluoresce rapidamente a como liga-se ao negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma ao entrar na célula através da lesão de membrana (Figura 2& 3). quantificação da fluorescência do corante adjacente à lesão de membrana permite o monitoramento do tempo que leva para a membrana da célula de selar em si. Para exemplificar a utilidade desse método, usamos dysferlinopathy paciente fibroblastos transfectados com plasmídeos dysferlin completos GFP-conjugados (DYSF) para avaliar o resgate de reparo da membrana celular.