Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Bu protokol için özetlenen tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Lincoln Üniversitesi – iletişim kuralı #1435 altında Nebraska tarafından onaylanmıştır. 1. hazırlık Çözümler ve kültür ortamı hazırlanması Tüm kültür medya ve arabellek Malzemeler tablogöre hazırlayın. Aletleri hazırlanması Bir su banyosu ayarla (> 10 L) 42 ° C, değişken hız ve şişeler tutan kelepçeleri Peristaltik pompa. Eğri makas ve forseps (şekil 1) hazırlayın. Tarih veya bitişik su banyosu, 20 x 20 cm parça (şekil 1) kesme bir emici underpad ile overlaid bir fırın tepsisine (yaklaşık 38 x 26 cm) ile bir köpük yastık (50 mL konik raf) ayarlayın. Yakın maskeleme bandı (5-8 cm) bir parça yerleştirin. 20 cm polyester dikiş ipliği Yani kesme ve kullanıma hazır yakın yerleştirin. Plastik bir kateter geri çekilebilir bir iğne ile (7 mm x 19 mm, şekil 1) elde edilir. Züccaciye Mağazaları hazırlanması Kelepçeler kullanılarak, yer ve hareketsiz bir 1 L şişesi 200 mL 1 x PBS çözüm içine gidiş iki 1 mL Pipetler vardır bir tıpa ile içeren su banyosu. Lastik Mantar devridaim sıvı bir kapalı devre izin vermek için çentikli. Başka bir kelepçe ile tampon 2 45 mL sıvı sıvı kalır ve balonun oksijen darbeler alt şişeye ve diğer biri iki 1 mL Pipetler, vardır bir tıpa ile birlikte içeren bir 125 mL şişe yerleştirin.Not: Her pipet Stoppers kolay tüp geçiş için sonu iliştirilmiş adaptörü çıkarın hızlı olacaktır. Oksijen yavaşça sıvı içinde dalmış değil tıpa pipet ile her iki şişe içine akan. Steril crystallizing tabağı kenara. 2. hayvan yordamı PBS ve tampon 2 çözümleri 42 ° c su banyosunda ısınmak ve PBS için en az 20 mL/dak tüp sıvı hatları sıcak tutmak için bir kapalı devre içinde dolaşımda. Aşırı herhangi bir boru içinde kalmak için su banyosu bırakın 42 ° C’ye mümkün olduğunca yakın Erkek sonuna 1 L şişe içeren PBS içine tüp drenaj. Bir pamuk topağı üzerinde emici underpad yerleştirin ve yaklaşık 2 mL (polietilen hangi isoflurane buharlaşma hızı azalır glikol içinde 200 kadar yapılmış) % 30 isoflurane transfer pipet kullanarak pamuk topu ekleyin. Fareyi kuyruğundan almak, crystallizing yemekleri taşıyıcıya yerleştirin ve fare anestezi nefes için küçük bir yerde olması çanak pamuk üzerine hızla devirmek. Fare nefes oranını gözlemlemek ve fare etkili anestezi altında olduğundan emin olun.Not: Solunum hızı daha yavaş ve daha derin, olmalıdır kuyruk sarkık ve pençeleri yanıt vermeyen çimdik testi altında anestezi; IACUC kurallar ek ayrıntılar için bkz. Süre (1-2 dakika sürer) anestezi altında fare oluyor, bir 10 mL şırınga varil pistonu çekerek ve küçük bir pamuk ekleme hazırlamak. Pamuk varil içinde 1-2 mL % 30 isoflurane transfer pipet ile eklemek ve bilinçsiz olmak için fare beklerken varil bir masada aşağı open-end yerleştirin. Hızlı bir şekilde crystallizing çanak, fare sırtını çevirme alıp şırınga varil burnu yerleştirin. İki kez kontrol solunum hızı, ayak çimdik ve sarkık kuyruk. Ayak çimdik ve sarkık kuyruk için herhangi bir yanıt fare değil tam anestezi altında olduğunu gösterir. Şırınga varil bilinçsizlik korumak için burun üzerinde tutun. Belgili tanımlık paws sırtüstü pozisyonda uzanmış uzuvları ile fare aracılığıyla yer başparmak tacks. Karın ve göğüs kafesi % 70 isopropanol veya etanol ile ıslak. Bir elinde düz Forseps ile karın yakın cilt kaldırın. Diğer elinde makasla kesilmiş çadır cilt ve karın zarını. Belgili tanımlık kesme yatay veya çadır cilt Bankası arasında olmalıdır. Gut erişim kazanmak için tüm cilt ve Periton katmanından kesmek emin olun. Yanal göğüs kafesi kadar karın çevresinde her iki tarafta herhangi bir organ nicking olmadan kesti. Cilt kapağı kesim tarafından daha düşük göğüs kafesi kesilmiş. Bağırsak portal ven ortaya çıkarmak için forseps arkasına ile sağa doğru ilerleyin.Not: hayvandan kanama en az olmalıdır; hayvan hala nefes ve derin anestezi altında. Kapalı eğri forseps karaciğer ve üstün pancreaticoduodenal ven (şekil 3 ok) arasında portal ven altına yerleştirin. Forseps portal ven iken altında açın. İş parçacığı tutun ve portal ven ortalanacak şekilde dikkatlice çekin. Aşağı cinching olmadan portal ven çevresinde bir yukarıdan aşağı düğüm kravat. Portal ven altında kıvrımlı pensler yerleştirin ve yavaşça ven (şekil 4A) düzeltmek için fare kuyruğu doğru çekin. Diğer elinde sonda ile iğne eğimi yukarı doğru ve alt kısmında forseps (şekil 4B) yakınındaki portal ven paralel yerleştirin. Yavaşça ven iğne (şekil 4C) ile delik. İğneyi konik ven Lümen içinde olduğundan emin olun. Yaylı iğne geri çekmek ve eğimi Venöz dallı alandır kadar damar yoluyla polimer kateter itmeye devam edin. Karaciğer içinde bu. Kateter doğru şekilde yerleştirilmiş olması durumunda, kan akışının arka görünür hale gelir. (Şekil 4D). Yukarıdan aşağı düğüm sıkın ve stabilize yardımcı olmak için kateter üzerinde aşağı çekin. Hemen 20 mL/dk dan Pompa hızı 4 mL/dk geri çevirmek ve drenaj için başka bir büyük kan damarı kesilmiş. En iyi sonuçlar için aorta abdominalis kesti. Erkek kadın sonuna kadar kateter (şekil 5A) boru sonuna yerleştirin. Başında hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Kateter da karaciğer içine veya damar dışına itti değil dikkatli olun. Damar dışına geri akış önlemeye yardımcı olur ve doğru konumda (şekil 5B, C) kateter tutmanıza yardımcı olur iş parçacığı yerleşimini temel, değildir. Boru underpad üzerine immobilize için maskeleme bandı kullanın. Bir kaç kez karaciğer şişirmek için atık kan damarı sıkmak için düz forseps kullanın tüm kan (şekil 5D) drene emin olmak için.Not: Standart laboratuvar bant işe yaramayabilir; Ancak, maskeleme bandı için ıslak koşullarda bile underpad takılıp kalır. 3. karaciğer perfüzyon Karaciğer PBS ile kızarma, Collagenase tip IV yaklaşık 24 mg ölçmek ve tampon 2 45 mL su banyosunda içeren şişeye koyun. Böylece collagenase tam olarak feshedilmiştir sıvı şişeye girdap ve böylece şişeye sıvı içeren bölümünü tamamen suda batık şişeye geri kelepçe içinde yer emin olun. PBS ile aktarılmadan olarak karaciğer renk değişikliği gözlemlemek. Çıkış boru 1 L şişesi 125 mL şişe için değiştirin. Karaciğer akmaya hava kabarcıkları izin vermez. Perfüzyon arabellek karaciğer ulaştıktan sonra kısa bir süre sıkı atık damar bazı basınç gemi içinde oluşturmak ve bu sıvının bütün karaciğer lobları doldurmak izin vermek için sıkmak. Bu karaciğer (Glisson’ın kapsül) çevreleyen ince bağ dokusu patlama ve perfüzyon veya karaciğer kapiller yatak içinde sıvı yok gibi drenaj çok uzun kesmemeye dikkat edin. Tampon 2 collagenase tüm 45 mL akan kadar doku ile karaciğer sıvı ile izin verir.Not: Eğer başarılı olursa, Glisson’ın kapsül ayrılmalıdır parankimi ya da karaciğer dokusu ve karaciğer kendini amorf görüntülenmesi gerekir. Diğer crystallizing yemek için tampon 1 yaklaşık 10 mL ekleyin ve yanındaki fareyi getirin. Kateter kaldırmak ve pompa devre dışı. Düz forseps ve makas ile karaciğer fare kesmek. Collagenase sindirim çok etkili olsaydı, el üstünde fare karaciğer kepçe ve tampon 1 yeri temiz, steril bir kaşık alabilir gerekli olabilir. 4. Hepatosit arıtma Not: Hücreleri manipülasyon bir steril doku kültürü Hood kontaminasyon hücreleri tüm sonraki adımlar kültürlü olmak istiyorsak sınırlamak için yapılmaktadır. Steril tekniği kullanarak, karaciğer Forseps ile kapmak ve karaciğer hücrelerinden hafifçe çalkalanır. Altını üstüne getirin veya geri çekme Glisson’ın kapsül: hücreleri karaciğer sarsılmış gibi arabellek opak olacaktır. Hücre çözümü yerleştirilmiş 100 µm filtre ile 50 mL konik dökün. Daha fazla tampon 1 karaciğer kalıntıları ekleyin ve hücreleri titremeye devam edin. Karaciğer hücreleri veya ne zaman karaciğer sindirilmemiş bölümlerini artık hücreleri verimi değil yoksun görünene kadar devam edin. Hücresel sıvı başka bir 50 mL 40 µm filtre içeren konik dökün. Konik bir sallanan kova Open End 100 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi.Not: Bu hücre Pelet çıkarmak en fazla fren kullanmayın. Tüm kalan Santrifüjü adımları 4 ° C’de için yeterli olan , fren kullanın (Hangi içermek NPCs ve ölü tetkikine) süpernatant temiz konik dökün ve buz üzerinde yerleştirin. Bu Pelet bağlılık gözlemlemek için bir hareket yapılır emin olun. Pelet tampon 1 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları yineleyin. Pelet tampon 3 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları iki kez tekrarlayın. Arıtılmış tetkikine sıcak DMEM + 10 resuspend % FBS + 2 x penisilin-streptomisin (kalem/Strep). Hücreleri kollajen kaplı Tabaklarda kültürlü, 1 h için bağlı kalmak izin ve Değiştir medya en az bir kez bu kadar herhangi bir yeni doğmakta olan bakteriyel kirletici engeller. Onları % 0.001 Asetik asit için en az 1 h 37 ° C’de % 0.05 kollajen ile kuluçka ve 1 x PBS ile yıkama tarafından kolajen kaplı levha olun. Hepatosit canlılığı düşüktür ve arıtılmış yüksek uygun tetkikine elde sonra Kreamer ve ark10′ dan adapte aşağıdaki iletişim kuralını kullanmak için bir istek varsa. Mix 9 birimleri PVP çözüm (Percoll, % 23 w/w çözüm su ve 15-30 nm kolloidal silika partikülleri polyvinylpyrrolidone yoğunluğu Santrifüjü için kaplı) ve ISO ozmotik PVP çözümünü (SIP) yapmak için 10 x HBSS 1 hacmi. Bir steril 50 4 ° C’de 2 aya kadar bu koşullarda depolanan ml konik SIP 24 mL ekleyin 5-10 × 106 hücre/ml kültür orta adım 4,8 not ettiğiniz biri gibi ile Hepatosit konsantrasyon ayarlayın. Hücre süspansiyon 25 mL her 24 mL konik içeren SIP ve nazik INVERSION tarafından karıştırın. Bu çözüm 1.06 g/mL yoğunluğudur. Konik, 50 x g 4 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi SIP ve flocculant Aspire edin ve HBSS hücrelerde resuspend. Santrifüjü 50 x g 4 ° C’de 10 dakika için de tarafından hücreleri yıkama Adımı 4.10.6 bir kez daha yineleyin ve sonra hücre büyüme orta resuspend. 5. sn arıtma Adım 4.6 supernatants hücrelerde tüpler 163 x g 10 dk. atmak için de iplik tüpler üzerinden supernatants cips ve tüm hücre pellet RPMI 5 ml serum olmadan resuspend ve onları birlikte bir tüpte Havuzu. Bir kez tüm pellets havuzlu, RPMI 35 mL son hacim için ekleyin. Havuza alınan santrifüj kapasitesi 25 x g, konik bir temiz 50 ml konik buzda NPCs içeren bu medya RPMI en iyi 25 mL 25 mL pipet ve yer ile 3 dk. dikkatle Aspire için. Taze RPMI 25 mL tüp geri ekleyin ve Pelet resuspend. 5.3 ikinci yıkama ve havuzu süpernatant için adımları yineleyin. Kalan 10 mL medya ve Pelet (çoğunlukla ölü tetkikine Pelet oluşur) atmak. Havuza alınan süpernatant vasıl 163 x g 10 dk santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sırasında PVP çözüm degradeler 50 ml konik hazırlayın. 15 mL % 50 PVP çözeltisi 50 ml konik Percoll fırlatma hızını yavaşlatmak için ayarla bir pipettor ile overlaid % 25 20 mL ardından ekleyin. Bu saniye sürdü ve KCs Santrifüjü sonra nerede toplamak olduğu gibi iki kat demarcates 15 mL işareti bir kırılma satırında gözlemlemek emin olun. Soğuk RPMI adım 5.5 10 mL içinde daha önce pelleted hücreleri resuspend ve onları PVP çözüm degrade yerleşimi. İki kat arasında net bir sınır korumak emin olun. Degrade vasıl 805 x g 20 dk santrifüj kapasitesi % 50 ayarlamak bir fren. Tüp 20 mL işaretine yukarıdan aşağıya doğru yönde Aspire edin ve bu malzeme atın. 5 mL transfer pipet ile saniye sürdü ve /50 arayüzü bulunmaktadır KCs toplamak. Bu ölü tetkikine olarak hücreleri herhangi bir kahverengi kümeleri atmak. Hücreleri bir 50 mL konik yerleştirin ve RPMI PVP çözüm sulandırmak için 50 mL işareti kadar ekleyin. 200 x g 10 dk için de % 80 fren ile santrifüj kapasitesi. Aspire edin ve süpernatant atın ve sıcak RPMI 12 ml konik koni kapalı yıkarken Pelet resuspend. Saniye KCs süpernatant bir polistiren Petri kabına koyarak ayırın ve oksijen doku kültürü kuluçka oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya. Medya bir 25 mL pipet ve durulama KCs süre kalan saniye toplamak için en düşük hızda ayarla pipettor ile aynı medya ile plaka uygun plaka ile Aspire edin. Saniye 200 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve resuspend RPMI + % 5 içinde FBS + kalem/Strep. O zaman titresi hücreleri ve kolajen kaplı kültür yemekleri yerde.