Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

Tutte le procedure degli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l’Università di Lincoln – Nebraska sotto protocollo #1435. 1. preparazione Preparazione di terreni di coltura e soluzioni Preparare tutti i terreni di coltura e tampone secondo la Tabella dei materiali. Preparazione di strumenti Impostare un bagno d’acqua (> 10 L) a 42 ° C, una pompa peristaltica con velocità variabile e morsetti per lo svolgimento di boccette. Preparare le forbici curve e forcipe (Figura 1). Su o adiacente al bagno d’acqua, impostare una teglia da forno (circa 38 x 26 cm) con un pad di polistirolo (cremagliera conica 50 mL), sovrapposto con un assorbente underpad tagliate un pezzo di 20 x 20 cm (Figura 1). Posizionare un pezzo di nastro adesivo (5-8 cm) nelle vicinanze. Posto un cucirino Poliestere 20cm nelle vicinanze che è tagliato e pronto all’uso. Ottenere un catetere di plastica con un ago retrattile (7 mm x 19 mm, Figura 1). Preparazione di oggetti di vetro Con fascette, posizionare e immobilizzare una L 1 pallone nel bagno d’acqua che contiene 200 mL di 1X PBS con un tappo che ha due pipette da 1 mL andando nella soluzione. Il tappo di gomma è dentellato per consentire il ricircolo del fluido in un circuito chiuso. Con un altro morsetto, posto una bottiglia di 125 mL contenente 45 mL di tampone 2 insieme con un tappo che ha due pipette da 1 mL, uno dei quali è nel liquido nella parte inferiore del pallone e l’altro che rimane sopra il liquido e soffia ossigeno nel pallone.Nota: Ogni pipetta nei tappi avrà un rapido scollegare l’adattatore collegato alla fine per il facile passaggio del tubo. Ossigeno sarà delicatamente che scorre in entrambi palloni tramite la pipetta nel tappo che non è immerso nel liquido. Mettere da parte due piatti di cristallizzazione sterile. 2. procedura animale Riscaldare le soluzioni PBS e Buffer 2 a 42 ° C nel bagno d’acqua e circolare PBS per almeno 20 mL/min della tubazione a circuito chiuso per mantenere le linee di liquide caldo. Immergere ogni tubo in eccesso nel bagno d’acqua a rimanere più vicino possibile a 42 ° C. Drenare l’estremità maschio del tubo nel PBS contenente L 1 boccetta. Posizionare un batuffolo di cotone sul underpad assorbente e aggiungere circa 2 mL di 30% isoflurane (composta in polietilene glicole 200 che diminuisce il tasso di evaporazione di isoflurane) sul batuffolo di cotone con una pipetta di trasferimento. Sollevare il mouse per la coda, inserirlo in uno dei piatti di cristallizzazione e quindi rapidamente rovesciare il piatto sopra la palla di cotone, così che il mouse ha un piccolo spazio in cui inalare l’anestesia. Osservare la frequenza respiratoria del mouse e verificare che il mouse viene efficacemente nell’ambito dell’anestesia.Nota: La frequenza respiratoria dovrebbe essere più lento e più profondo, la coda flaccido e le zampe non rispondono alla prova di pizzico sotto anestesia; Vedi linee guida IACUC per ulteriori dettagli. Mentre il mouse è in corso nell’ambito dell’anestesia (questo richiede 1-2 min), preparare la canna di una siringa da 10 mL tirando fuori lo stantuffo e inserendo un batuffolo di cotone piccolo. Aggiungere 1-2 mL di 30% isoflurane con una pipetta di trasferimento per il batuffolo di cotone all’interno della canna e posizionare la canna fissa giù su un tavolo durante l’attesa per il mouse a diventare inconscio. Rapidamente togliere il piatto di cristallizzazione, capovolgere il mouse sul dorso e posizionare il corpo della siringa sul suo naso. Doppio controllo il tasso di respirazione, pizzico di punta e coda flaccida. Tutte le risposte per il pizzico di punta e coda flaccida indica che il mouse non è completamente sotto anestesia. Tenere la siringa sopra il muso per mantenere uno stato di incoscienza. Puntine di luogo attraverso le zampe del mouse, con le membra tesato in posizione supina. Bagnare l’addome e la gabbia toracica con 70% isopropanolo o etanolo. Con il forcipe dritto in una mano, sollevare la pelle vicino alla base dell’addome. Con le forbici in mano, tagliare la pelle tenda e il peritoneo. L’incisione deve essere orizzontale o attraverso la base della pelle tenda. Assicuratevi di tagliare attraverso tutti gli strati della pelle e del peritoneo per poter accedere all’intestino. Tagliare lateralmente intorno all’addome fino alla gabbia toracica su entrambi i lati senza intaccare qualsiasi organo. Tagliato il lembo di pelle dal taglio attraverso la gabbia toracica inferiore. Spostare l’intestino a destra con la parte posteriore delle pinze per esporre la vena portale.Nota: Sanguinamento dall’animale dovrebbe essere minimo; l’animale deve essere ancora respirando e sotto anestesia profonda. Posizionare il forcipe curvo chiuso sotto la vena portale tra il fegato e la vena pancreaticoduodenale superiore (freccianella figura 3 ). Aprire la pinza mentre sotto la vena portale. Afferrare il filo e passarlo attentamente affinché sia centrato sotto la vena portale. Legare un nodo semplice intorno alla vena portale senza cinching esso giù. Posizionare il forcipe curvo sotto la vena portale e tirarlo delicatamente verso la coda del mouse per raddrizzare la vena (Figura 4A). Con il catetere in altra mano, posizionare la smussatura dell’ago a faccia in su e in parallelo con la parte inferiore della vena portale vicino il forcipe (Figura 4B). Delicatamente la puntura della vena con l’ago (Figura 4C). Garantire che la smussatura dell’ago è nel lume della vena. Ritirare l’ago a molla e continuare a spingere il catetere di polimero attraverso la vena fino a quando la smussatura è vicino alla zona di ramificati venosa. Questo è all’interno del fegato. Se il catetere è posizionato correttamente, è possibile che un riflusso di sangue sarà visibile. (Figura 4D). Stringere il nodo alla marinara e tirare verso il basso sul catetere per contribuire a stabilizzare esso. Immediatamente girare verso il basso il tasso di pompa da 20 mL/min a 4 mL/min e tagliare un altro vaso sanguigno principale per il drenaggio. Tagliare il centrifugalis dell’aorta per ottenere risultati ottimali. Inserire l’estremità maschio del tubo per l’estremità femmina del catetere (Figura 5A). Assicurarsi che non siano senza bolle d’aria nella linea. Fare attenzione che il catetere non è neppure spinto nel fegato o out of the vein. Posizionamento del thread non è essenziale, anche se aiuta a prevenire il riflusso out of the vein e aiuta a mantenere il catetere nella posizione corretta (Figura 5B, C). Utilizzare nastro adesivo per immobilizzare il tubo sulla traversa. Utilizzare il forcipe dritto per spremere il vaso sanguigno degli effluenti per gonfiare il fegato un paio di volte a garantire tutto il sangue fuoriuscire(Figura 5).Nota: Il nastro di laboratorio Standard potrebbe non funzionare; Tuttavia, nastro adesivo rimarrà bloccato per underpad, anche in condizioni di bagnato. 3. fegato perfusione Mentre il fegato è di lavaggio con PBS, misurare circa 24 mg di collagenasi di tipo IV e posizionarlo nel matraccio contenente 45 mL di tampone 2 nel bagno d’acqua. Essere sicuri di turbinio il liquido nel pallone, affinché la collagenasi sia completamente dissolto e posizionare il pallone indietro nel morsetto in modo che la parte liquida contenente del pallone è completamente immersa nell’acqua. Osservare il cambiamento di colore del fegato come esso viene svuotata con PBS. Cambiare il tubo di deflusso dalla beuta 1l al pallone da 125 mL. Non lasciare bolle d’aria di fluire nel fegato. Una volta che il buffer di perfusione raggiunge il fegato, brevemente spremere stretto il vaso sanguigno degli effluenti per costruire un po’ di pressione all’interno del vaso e consentire questo liquido riempire tutti i lobi del fegato. Essere sicuri di non tagliare troppo a lungo, di drenaggio come che potrebbe scoppiare il sottile tessuto connettivo che circonda il fegato (capsula di Glisson) e distruggere la perfusione o il flusso di liquido all’interno del letto capillare del fegato. Consentire 2 Buffer con collagenasi per irrorare attraverso il fegato, fino a quando tutti i 45 mL fluito attraverso il tessuto.Nota: In caso di successo, capsula di Glisson deve essere separato dal parenchima o tessuto del fegato e il fegato stesso dovrebbe apparire amorfo. Aggiungere circa 10 mL di tampone 1 altro piatto il cristallizzazione e posizionarlo accanto al mouse. Rimuovere il catetere e spegnere la pompa. Con il dritte pinze e le forbici, tagliare il fegato dal mouse. Se la digestione della collagenosi era molto efficiente, può essere necessario avere un cucchiaio pulito, sterile pronto a scoop il fegato dal mouse e posizionarlo in Buffer 1. 4. dell’epatocita purificazione Nota: La manipolazione delle cellule vengono eseguiti in una cappa sterile coltura tissutale per limitare la contaminazione se le celle sono di essere colta in tutti i passaggi successivi. Utilizzando una tecnica sterile, afferrare il fegato con il forcipe e agitare delicatamente le cellule dal fegato. Lacerare o tirare indietro la capsula di Glisson: buffer diventerà opaco come le cellule sono scossi dal fegato. Versare la soluzione di cella in un 50 mL conica con un 100 µm filtro posto sopra la parte superiore. Aggiungere più Buffer 1 ai resti del fegato e continuare a scuotere fuori le cellule. Continuare fino a quando il fegato appare privo di cellule o quando le parti non digerite del fegato non danno piu ‘ cellule. Versare il liquido cellulare in un altro 50 mL conico contenente un filtro di 40 µm. Centrifugare la conica in un rotore oscillante a 100 x g per 3 min.Nota: Non utilizzare il freno massimo come questo può sloggiare il pellet cellulare. Usare il freno all’80%, che è sufficiente per tutti i passaggi rimanenti di centrifugazione a 4 ° C Versare il sovranatante (che contiene gli NPC ed epatociti morti) in un pulito conico e posizionarlo sul ghiaccio. Garantire che ciò avvenga in un unico movimento per osservare l’aderenza della pallina. Risospendere il pellet in 40 mL di tampone 1. Ripetere i passaggi da 4.5 e 4.6. Risospendere il pellet in 40 mL di tampone di 3. Ripetere i passaggi da 4.5 e 4.6 due volte. Risospendere gli epatociti purificati in caldo DMEM + 10% FBS + 2 x penicillina-streptomicina (Pen/Strep). Se le cellule sono coltivate su piastre di collagene rivestito, permettere loro di aderire per 1 h e sostituire i media almeno una volta come questo impedirà eventuali contaminanti batterici nascente. Rendere le piastre di collagene rivestito di incubarle con collagene 0.05% in acido acetico 0.001% per almeno 1 h a 37 ° C e successivamente lavate con PBS 1X. Se la vitalità dell’epatocita è bassa e c’è un desiderio di ottenere epatociti vitali alta purificati quindi utilizzare il seguente protocollo adattato da Kreamer et al10. Mix 9 volumi di soluzione PVP (Percoll, una soluzione di p/p di 23% di acqua e particelle di silice colloidale di 15-30 nm rivestite in polivinilpirrolidone per centrifugazione di densità) e 1 volume di 10 x HBSS per rendere una soluzione isoosmotica PVP (SIP). Aggiungere mL 24 di SIP a una sterile 50 mL conica che può essere memorizzato in queste condizioni fino a 2 mesi a 4 ° C. Regolare la concentrazione dell’epatocita a 5-10 × 106 cellule/mL con terreno di coltura come quello indicato al punto 4.8. Aggiungere 25 mL di sospensione cellulare per ogni mL 24 SIP contenente conico e mescolare capovolgendo. La densità di questa soluzione è 1,06 g/mL. Centrifugare la conica a 50 x g per 10 min a 4 ° C. Aspirare il SIP e flocculante e risospendere le cellule in HBSS. Lavare le cellule mediante centrifugazione a 50 x g per 10 min a 4 ° C. Ripetere il passaggio 4.10.6 ancora una volta e quindi risospendere le cellule in coltura. 5. SEC purificazione Agglomerare le cellule nei surnatanti dal passaggio 4.6 facendo girare i tubi a 163 x g per 10 min. scartare i surnatanti dai tubi e risospendere tutti delle palline delle cellule in 5 mL di RPMI senza siero e li riunire in una provetta. Una volta che tutti i pellet sono stati riuniti, aggiungere RPMI al volume finale di 35 mL. Centrifugare il pool conica a 25 x g per 3 min. Aspirare accuratamente la top 25 mL di RPMI con una pipetta da 25 mL e posto questo NPC che contenevano in un pulito 50 mL conica sul ghiaccio. Aggiungere 25 mL di RPMI fresco torna alla provetta e risospendere il pellet. Ripetere il passaggio 5.3 per un secondo lavaggio e piscina il supernatante. Scartare i rimanenti 10 mL di media e pellet (il pellet consiste principalmente di epatociti morti). Centrifugare il supernatante in pool a 163 x g per 10 min. Durante la centrifugazione, preparare i gradienti di soluzione PVP in un 50 mL conica. Aggiungere 15 mL di soluzione di PVP del 50% per i 50 mL conico seguita da 20 mL di Percoll overlaid con un pipettatore impostato la più lenta velocità di espulsione il 25%. Assicurarsi di osservare una linea di rifrazione al mark 15 mL che delimita i due strati, come questo è dove il SECs e KCs aggregherà dopo la centrifugazione. Risospendere le cellule precedentemente pellettate in punto 5.5 in 10 mL di RPMI freddo e le rivestirai sul gradiente di soluzione PVP. Assicuratevi di mantenere una netta demarcazione tra i due strati. Centrifugare la sfumatura a 805 x g per 20 min con un freno fissato al 50%. Aspirare dall’alto verso il basso direzione fino alla tacca di 20 mL sul tubo ed eliminare questo materiale. Con una pipetta di trasferimento di 5 mL, raccogliere il SECs e KCs che si trovano nell’interfaccia di 25/50%. Scartare qualsiasi marrone grumi di cellule come queste sono morti epatociti. Mettere le cellule in un 50 mL conica e aggiungere RPMI fino al contrassegno di 50 mL per diluire la soluzione di PVP. Centrifugare a 200 x g per 10 min, con freno di 80%. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet durante il lavaggio fuori del cono della conica in 12 mL di RPMI caldo. Separare il SECs da KCs inserendo il surnatante in una capsula di Petri di polistirolo e incubare in un incubatore umidificato coltura tissutale per 8 min a temperatura ambiente. Aspirare i media con una pipetta da 25 mL e sciacquare la piastra con gli stessi mezzi, con il pipettatore impostato alla velocità minima per raccogliere i restanti SECs mentre la KCs aderire alla piastra. Centrifugare il SECs a 200 x g per 10 min e risospendere in RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Quindi titolo le cellule e posto in piastre di coltura rivestite con collagene.