Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Alle Tiere in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Lincoln – Nebraska Protokolls #1435 genehmigt. 1. Vorbereitung Zubereitung von Lösungen und Kulturmedien Alle Kultur, Medien und Puffer nach der Tabelle der Materialienvorzubereiten. Aufbereitung von Instrumenten Richten Sie ein Wasserbad (> 10 L) bei 42 ° C, einer peristaltischen Pumpe mit variabler Geschwindigkeit und Klemmen für die Abhaltung von Flaschen. Bereiten Sie gebogene Scheren und Pinzetten (Abbildung 1). Richten Sie auf oder neben dem Wasserbad ein Backblech (ca. 38 x 26 cm) mit einem Styropor-Pad (50 mL konische Rack), überlagert mit einem saugfähigen Unterlage geschnitten, ein 20 x 20 cm Stück (Abbildung 1). Legen Sie ein Stück Klebeband (5-8 cm) in der Nähe. Legen Sie ein 20 cm Polyester Nähfaden in der Nähe d. h. Schnitt und einsatzbereit. Erhalten Sie einen Kunststoff-Katheter mit einer versenkbaren Nadel (7 mm x 19 mm, Abbildung 1). Herstellung von Glaswaren Verwenden Klammern, platzieren und eine 1 L Flasche im Wasserbad mit 200 mL 1 X PBS mit einem Stopfen, der zwei 1 mL Pipetten gehen in die Lösung zu immobilisieren. Der Kautschuk-Kork ist eingekerbt, um Umwälzung der Flüssigkeit in einem geschlossenen Kreislauf zu ermöglichen. Legen Sie mit einem anderen Klemme eine 125 mL Flasche mit 45 mL Puffer 2 zusammen mit einem Stopfen, der hat zwei Pipetten 1 mL, von denen in der Flüssigkeit im unteren Teil der Flasche und der andere ist die bleibt oberhalb der Flüssigkeit und Sauerstoff in die Flasche bläst.Hinweis: Jede Pipette in die Stopper haben eine schnelle Adapter am Ende für einfaches Umschalten der Schläuche zu trennen. Sauerstoff wird sanft in beide Kolben über die Pipette in der Stopper fließen, die nicht in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Zwei sterile kristallisierenden Teller beiseite stellen. (2) Tier Verfahren Die PBS und Puffer 2 Lösungen auf 42 ° C im Wasserbad erwärmen Sie und zirkulieren Sie PBS für mindestens 20 mL/min in den Schlauch in einem geschlossenen Kreislauf die Zufuhrleitungen warm zu halten. Tauchen überschüssigen Schlauch in das Wasserbad bleiben so nah wie möglich an 42 ° C. Entleeren Sie das männlichen Ende des Schlauches in die 1 L Flasche mit PBS. Einen Wattebausch auf das saugfähige Unterlage geben Sie und ca. 2 mL 30 % Isofluran (bestehend in Polyethylenglykol 200 das verringert die Verdunstung von Isofluran) auf den Wattebausch mit einer Transferpipette. Heben Sie die Maus am Schwanz, legen Sie sie in eines der kristallisierenden Gerichte und dann stürzen Sie schnell die Schüssel auf den Wattebausch, damit die Maus verfügt über einen kleinen Raum, in dem die Narkose zu inhalieren. Beobachten Sie die Atemfrequenz der Maus zu und sicherstellen Sie, dass die Maus effektiv unter Narkose ist.Hinweis: Die Atemfrequenz sollte langsamer und tiefer, die Rute schlaffen und die Pfoten ausweichenden zu Kneiftest unter Narkose; siehe Richtlinien für IACUC für weitere Details. Während die Maus unter Narkose geht (Dies dauert ca. 1-2 min.), bereiten Sie den Lauf einer 10 mL Spritze durch Herausziehen des Kolbens und einen kleinen Wattebausch einlegen. Der Wattebausch in den Lauf 1 – 2 mL 30 % Isofluran mit einer Transferpipette hinzu und stellen Sie den Lauf Open-End nach unten auf einen Tisch während des Wartens auf die Maus, um bewusstlos zu werden. Schnell kristallisieren Schale nehmen Sie ab, drehen Sie die Maus auf dem Rücken und legen Sie den Spritzenkörper über seine Nase. Überprüfen Sie die Atemfrequenz, Zeh kneifen und schlaffer Schweif. Alle Antworten auf die Zehe Prise und schlaffer Schweif zeigt, dass die Maus nicht vollständig unter Narkose. Halten Sie den Spritzenkörper über die Schnauze zu Bewusstlosigkeit. Ort Reißzwecken durch die Pfoten der Maus mit den Gliedmaßen ausgestreckt in Rückenlage. Feuchten Sie den Bauch und Brustkorb mit 70 % Isopropanol oder Ethanol. Heben Sie mit der geraden Zange in der Hand die Haut in der Nähe der Basis des Bauches. Schneiden Sie mit einer Schere in der anderen Hand das Zelt Haut und Bauchfell. Der Schnitt sollte horizontal oder auf der Basis der zeltförmige Haut. Achten Sie darauf, alle Schichten der Haut und Bauchfell durchtrennt, um Zugriff auf den Darm. Schneiden Sie seitlich um den Bauch bis zu den Brustkorb auf beiden Seiten ohne nicking eines der Organe. Schneiden Sie die Klappe der Haut durch Schneiden in den unteren Brustkorb. Bewegen Sie den Darm auf der rechten Seite am hinteren Teil der Zange, die Pfortader verfügbar zu machen.Hinweis: Blutungen aus dem Tier sollte minimal sein; das Tier sollte noch atmen und Tiefe Narkose. Legen Sie die geschlossenen gebogenen Zange unterhalb der Pfortader zwischen Leber und überlegene Pancreaticoduodenal Vene (Abbildung 3 Pfeil). Öffnen Sie die Zange während unterhalb der Pfortader. Fassen Sie den Faden und ziehen Sie sie vorsichtig durch, so dass es unter der Pfortader zentriert ist. Binden Sie einen Überhandknoten um die Pfortader, ohne sich frech. Legen Sie die gebogene Pinzetten unter die Pfortader und ziehen Sie es vorsichtig nach hinten von der Maus zu begradigen die Vene (Abb. 4A). Legen Sie mit dem Katheter in der anderen Hand die schräge der Nadel aufgedeckt und parallel mit dem unteren Teil der Pfortader in der Nähe der Zange (Abb. 4B). Sanft Punktion der Vene mit der Nadel (Abb. 4C). Stellen Sie sicher, dass die Abschrägung der Nadel in das Lumen der Vene ist. Die federbelastete Nadel zurückziehen und weiterhin den Polymer-Katheter durch die Vene zu drücken, bis die Abschrägung in der Nähe des venösen verzweigt ist. Dies ist in der Leber. Wenn der Katheter richtig plaziert ist, wird ein Rückfluss des Blutes sichtbar sein. (Abbildung 4D). Ziehen Sie den Überhandknoten und ziehen Sie es nach unten, den Katheter zu helfen es zu stabilisieren. Sofort drehen Sie die Pumprate von 20 mL/min bis 4 mL/min und schneiden Sie einen anderen großen Blutgefäß für die Entwässerung. Schneiden Sie die Aorta Abdominalis für optimale Ergebnisse. Setzen Sie den Stecker der Schläuche an die Buchse des Katheters (Abb. 5A). Sicherstellen Sie, dass keine Luftblasen in der Zeile vorhanden sind. Achten Sie darauf, dass der Katheter nicht entweder in der Leber oder aus der Vene geschoben. Platzierung des Gewindes ist nicht notwendig, aber es verhindert Rückfluss aus der Vene und verhindert, dass den Katheter in der richtigen Position (Abbildung 5B, C). Verwenden Sie Klebeband um den Schlauch auf die Unterlage zu immobilisieren. Der geraden Zange verwenden, um das Abwasser Blutgefäß um die Leber ein paar Mal aufblasen zu pressen um sicherzustellen das Blut hat (Abbildung 5D) abgelassen.Hinweis: Standard-Labor-Band funktioniert nicht; Masking Tape bleibt jedoch fest an der Unterlage, auch bei Nässe. 3. Leber Perfusion Während die Leber mit PBS Spülung, Messen Sie, etwa 24 mg Kollagenase Typ IV und legen Sie sie in die Flasche mit 45 mL Puffer 2 im Wasserbad. Achten Sie darauf, die Flüssigkeit in der Flasche wirbeln, so dass die Kollagenase vollständig gelöst ist und den Kolben zurück in die Klemme zu platzieren, so dass die Flüssigkeit enthaltende Teil des Kolbens vollständig im Wasser untergetaucht ist. Beobachten Sie die Veränderung der Farbe der Leber, wie es mit PBS gespült wird. Ändern Sie den Abfluss Schläuche aus der 1 L Flasche in der 125 mL Flasche. Erlauben Sie keine Luftblasen in der Leber fließen. Sobald der Puffer Perfusion die Leber erreicht, kurz drücken Sie fest das Abwasser Blutgefäß zum Aufbau etwas Druck innerhalb des Schiffes und lassen Sie diese Flüssigkeit alle Lappen der Leber zu füllen. Achten Sie darauf, nicht abgeschnitten Entwässerung zu lang, denn das kann platzen die dünne Bindegewebe rund um die Leber (Glisson Kapsel) und die Perfusion oder Strömung der Flüssigkeit innerhalb der Kapillare Bett der Leber zerstören. Ermöglichen Sie Puffer 2 mit Kollagenase, durch die Leber durchspülen, bis alle 45 mL haben floss durch das Gewebe.Hinweis: Bei Erfolg der Glisson Kapsel getrennt werden sollten aus dem Parenchym oder das Lebergewebe und die Leber sollte sich amorphe erscheinen. Die kristallisierenden Schale etwa 10 mL Puffer 1 hinzu, und legen Sie sie neben der Maus. Entfernen Sie den Katheter und schalten Sie die Pumpe aus. Schneiden Sie mit der geraden Zange und Schere die Leber von der Maus. Wenn die Kollagenase Verdauung sehr effizient war, ist es möglicherweise notwendig, haben einen sauberen, sterilen Löffel auf Seite zu schöpfen die Leber von der Maus und legen Sie sie in Puffer 1. 4. Hepatozyten Reinigung Hinweis: Manipulation der Zellen sind in einer sterilen Gewebekultur Kapuze, Verschmutzung zu begrenzen, sollen die Zellen kultiviert in alle weiteren Schritte werden durchgeführt. Mit steriler Technik, greifen Sie die Leber mit Zange und schütteln Sie die Zellen aus der Leber. Zerreißen oder zurückziehen der Glisson Kapsel: der Puffer wird undurchsichtig, wie Zellen aus der Leber erschüttert werden. Gießen Sie die Zelle-Lösung in ein 50 mL konische mit einem 100 µm-Filter über der Oberseite platziert. Die Leber Reste mehr Puffer 1 hinzu und schütteln Zellen weiterhin. Fortgesetzt, bis die Leber scheint frei von Zellen oder wenn die unverdaute Teile der Leber nicht mehr Zellen nachgeben. Ein weiterer 50 mL konisch mit einem 40 µm-Filter Gießen Sie die zelluläre Flüssigkeit. Zentrifugieren Sie die konische in eine schwingende Eimer-Rotor bei 100 X g für 3 min.Hinweis: Verwenden Sie die maximale Bremse nicht, da dies die Zelle Pellets verdrängen kann. Verwenden Sie die Bremse bei 80 %, die was für alle verbleibenden Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C ausreichend ist Der Überstand (enthält NPCs und tot Hepatozyten) in eine saubere konische abgießen und auf Eis legen. Stellen Sie sicher, dass dies in einer Bewegung, Einhaltung von Pellets zu beobachten. Das Pellet in 40 mL Puffer 1 aufzuwirbeln. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6. Das Pellet in 40 mL Puffer 3 aufzuwirbeln. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 zweimal. Aufschwemmen der gereinigten Hepatozyten in warmen DMEM + 10 % FBS + 2 x Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep). Wenn die Zellen auf Kollagen beschichtete Platten kultiviert werden, lassen für 1 h halten und ersetzen die Medien mindestens einmal als dies im Entstehen begriffenen bakterielle Verunreinigungen verhindert. Machen Sie die Kollagen beschichtete Platten durch Inkubation sie mit 0,05 % Kollagen in 0,001 % Essigsäure für mindestens 1 h bei 37 ° C, und dann mit 1 X PBS waschen. Wenn die Hepatozyten Lebensfähigkeit gering ist und es ein Wunsch ist, gereinigte hoch tragfähige Hepatozyten erhalten dann verwenden Sie das folgende Protokoll vom Ambiente Et Al10angepasst. Mix 9 Bände der PvP-Lösung (Percoll, einer 23 % w/w Lösung aus Wasser und 15-30 nm kolloidale Silica-Partikel in Polyvinylpyrrolidon für Dichte Zentrifugation beschichtet) und 1 Volumen von 10 X HBSS, eine Iso-osmotischen PvP-Lösung (SIP) zu machen. Fügen Sie ein steril 50 mL konische die in diesen Bedingungen für bis zu 2 Monate bei 4 ° c gespeichert werden kann hinzu, 24 mL von SIP Passen Sie die Hepatozyten Konzentration um 5 bis 10 × 106 Zellen/mL mit Kulturmedium wie in Schritt 4.8 notierte. Je 24 mL SIP mit konischen 25 mL Zellsuspension hinzu und mischen Sie durch sanfte Umkehrung. Die Dichte dieser Lösung ist 1,06 g/mL. Zentrifugieren Sie konisch 50 X g für 10 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie SIP und Flockungsmittel und aufzuwirbeln Sie Zellen in HBSS. Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 50 X g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie Schritt 4.10.6 einmal mehr und dann Aufschwemmen Sie Zellen im Wachstumsmedium. 5. s Reinigung Pellet-Zellen in die Überstände ab Schritt 4.6 durch Drehen der Röhren bei 163 X g für 10 min. verwerfen die Überstände aus den Rohren und Aufschwemmen aller Zelle Pellets in 5 mL RPMI ohne Serum und bündeln sie zusammen in eine Röhre. Sobald alle Pellets gebündelt haben, fügen Sie RPMI Endvolumen von 35 mL hinzu. Zentrifugieren der gepoolten konisch 25 X g für 3 min. vorsichtig Aspirieren die Top 25 mL RPMI mit einem 25-mL-Pipette und Ort dieses Medium mit NPCs in eine saubere 50 mL konisch auf Eis. 25 mL frisches RPMI das Rohr wieder hinzufügen und das Pellet Aufschwemmen. Wiederholen Sie Schritt 5.3 für einen zweiten waschen und Pool überstand. Die restliche 10 mL von Medien und Pellets (Pellet besteht hauptsächlich aus Toten Hepatozyten) zu verwerfen. Zentrifugieren Sie die gepoolten Überstand bei 163 X g für 10 min. Während der Zentrifugation bereiten Sie die PvP-Lösung Gradienten in ein 50 mL konisch. Hinzugeben Sie 15 mL 50 % PvP-Lösung für die 50 mL konische gefolgt von 20 mL 25 %, die Percoll mit einer Pipette auf die langsamste Geschwindigkeit Auswurf gesetzt überlagert. Achten Sie darauf, eine Brechung Linie an der 15 mL-Marke, die die beiden Schichten abgrenzt zu beobachten, wie das ist, wo die SECs und KCs nach der Zentrifugation aggregiert. Die Zellen, die zuvor in Schritt 5.5 von 10 mL kalte RPMI pelleted Aufschwemmen und auf der PvP-Lösung Farbverlauf zu überlagern. Achten Sie darauf, eine klare Abgrenzung zwischen den beiden Schichten zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Steigung bei 805 X g für 20 min mit einer Bremse auf 50 % festgelegt. Von oben nach unten Richtung bis 20 mL-Markierung auf dem Rohr abzusaugen und dieses Material verwerfen. Mit einer 5 mL-Transfer-Pipette sammeln Sie die SECs und KCs, die sich an der Schnittstelle von 25/50 % befinden. Braunen Klumpen von Zellen zu verwerfen, da diese Toten Hepatozyten sind. Legen Sie die Zellen in ein 50 mL konische und summieren Sie RPMI sich die 50 mL-Markierung, die PVP-Lösung zu verdünnen. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 10 min, mit 80 % Bremse. Aspirieren und den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets beim Abwaschen des Kegels des konischen in 12 mL warmen RPMI. KCs trennen Sie der SECs, indem man den Überstand in Polystyrol Petrischale und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für 8 min bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die Medien mit einem 25-mL-Pipette und spülen Sie die Platte mit den gleichen Medien, mit der Pipette auf die verbleibenden Sekunden während der KCs sammeln mit der niedrigsten Geschwindigkeit festgelegt haften bis auf den Teller. Zentrifugieren Sie die SECs bei 200 X g für 10 min und Aufschwemmen Sie RPMI + 5 % FBS + Pen/Strep. Dann Titer der Zellen und Platz in Kollagen beschichtet Kultur Gerichte.