小鼠肝灌注肝细胞和正弦内皮细胞的纯化

本议定书所概述的所有动物程序都已由林肯-内布拉斯加州大学的机构动物照料和使用委员会 (IACUC) 根据《议定书》 #1435 批准。 1. 准备 解决方案和培养培养基的制备 根据材料表准备所有区域性媒体和缓冲区。 仪器的准备 在42摄氏度设置一个水浴 (> 10 升), 一个可变速度的蠕动泵, 和保存烧瓶的夹子。准备弯剪刀和镊子 (图 1)。 在水浴上或旁边, 设置一个烘烤板 (约 38 x 26 厘米) 与发泡胶垫 (50 毫升圆锥机架), 覆盖与吸收垫切割成 20 x 20 厘米片 (图 1)。 在附近放置一块屏蔽胶带 (5-8 厘米)。放置一个20厘米涤纶缝纫线附近, 是削减和准备使用。获得一个可伸缩针的塑料导管 (7 毫米 x 19 毫米,图 1)。 玻璃器皿的制备 使用夹子, 放置和固定在水浴中的1升烧瓶, 其中包含200毫升 1x PBS 与一个塞子, 有两个1毫升吸管进入解决方案。橡胶软木有缺口, 允许循环液体在一个封闭的电路。 与另一个钳位, 放置一个125毫升瓶包含45毫升的缓冲2连同一个塞子, 有两个1毫升吸管, 其中之一是在液体附近的瓶子和其他保持在液体和吹氧到烧瓶。注: 在塞子的每个吸管将有一个快速断开适配器连接到年底, 以方便切换油管。氧气将通过在塞子中不浸入液体中的吸管轻轻地流入两个烧瓶中。 留出两个不育的结晶皿。 2. 动物做法 预热 pbs 和缓冲2解决方案到42°c 在水浴和流通 PBS 至少20毫升/分钟在管道中的封闭电路, 以保持液体线温暖。浸入水浴中的任何多余油管保持尽可能接近42摄氏度。将油管的男性端排入含有 PBS 的1升烧瓶中。 将一个棉球放在吸水垫上, 并添加约2毫升30% 异氟醚 (由聚乙烯乙二醇200组成, 通过转移吸管降低了异氟醚的蒸发率)。 拿起鼠标的尾巴, 把它放在一个结晶的菜肴, 然后迅速翻转到棉花球的菜, 使鼠标有一个小的空间, 其中吸入麻醉。观察鼠标的呼吸速度, 确保鼠标在麻醉下有效。注: 呼吸速率应较慢和更深, 尾部松弛, 爪子响应麻醉下的捏试验;有关其他详细信息, 请参阅 IACUC 指南。 当鼠标在麻醉下 (这需要1-2 分钟), 准备一个10毫升注射器的桶, 拔出活塞和插入一个小棉球。将30% 异氟醚的一毫升, 用转移吸管添加到枪管内的棉球上, 并将枪管放在桌子上, 等待老鼠变得不省人事。 快速摘下结晶盘, 翻转鼠标背部, 把注射器桶放在鼻子上。双检查呼吸率, 脚趾捏, 和松弛的尾巴。任何对脚趾捏和松弛的尾巴的反应表明, 老鼠没有完全在麻醉下。把注射器桶放在鼻子上保持无意识。 把拇指钉通过鼠标的爪子, 四肢伸出仰卧位。用70% 异丙醇或乙醇将腹部和肋骨保持湿润。 用直钳一只手, 抬起靠近腹部底部的皮肤。另一方面用剪刀剪帐篷的皮肤和腹膜。切口应该是水平的或在帐篷皮肤的底部。一定要切开所有层的皮肤和腹膜, 以获得进入肠道。侧面切开在腹部附近由肋骨笼子在两边没有偷任何器官。 通过下肋笼切开皮瓣。用镊子的背部将肠道向右移动, 以暴露门静脉。注: 动物出血应尽量少;该动物仍应呼吸和深度麻醉。 将闭合的弯曲钳放置在肝与上级十二指肠静脉之间的门静脉 (图 3箭头)。 在门静脉下方打开镊子。抓住线程, 仔细拉它通过, 使它在门静脉的中心。在门静脉周围系上一个上手结, 而不紧。 将弯曲钳放在门静脉下, 轻轻地将其拉向鼠标尾部, 以理顺静脉 (图 4A)。 另一方面, 用导管, 将针面的斜角与镊子附近的门静脉下部平行 (图 4B)。 用针轻轻穿刺静脉 (图 4C)。确保针的斜角在静脉腔内。收回弹簧针, 继续通过静脉推入聚合物导管, 直到斜面靠近静脉分支区域。这是肝脏内的如果导管正确放置, 血液的回流就会可见。(图 4D)。 拧紧的上手结和拉它在导管, 以帮助稳定它。立即将泵浦率从20毫升/分钟降低到4毫升/分, 并切开另一条主要的血管进行引流。切除主动脉腹型紫癜以获得最佳结果。 将油管的雄性末端置于导管的母端 (图 5A)。确保生产线上没有气泡。小心, 导管不是被推入肝脏或静脉。线程的放置并不重要, 但它有助于防止从静脉回流, 并有助于保持导管在正确的位置 (图 5B, C)。 使用屏蔽胶带将油管固定在垫上。使用直钳挤压出水血管, 使肝脏膨胀几次, 以确保血液耗尽 (图 5D)。注: 标准实验室胶带可能无法正常工作;然而, 即使在潮湿的情况下, 屏蔽胶带仍会粘在垫上。 3. 肝脏灌注 当肝脏冲洗与 PBS, 测量出约24毫克胶原酶 IV 型, 并把它放在含有45毫升缓冲2在水浴瓶。一定要旋流的液体在瓶中, 使胶原酶完全溶解, 并把瓶子放回钳, 使含有部分的液体瓶被完全淹没在水中。 观察肝脏的颜色变化, 因为它是由 PBS 冲洗。将流出油管从1升烧瓶改为125毫升烧瓶。不要让气泡流入肝脏。 一旦灌注缓冲到达肝脏, 简单地挤压排出的流出血管, 在血管内积聚一些压力, 让这个液体填满肝脏的所有裂片。确保不要把引流时间过长, 因为这可能会爆裂肝脏周围的薄结缔组织 (Glisson 的胶囊), 并破坏肝脏毛细血管床内的液体灌注或流动。 允许缓冲2与胶原酶灌注通过肝脏, 直到所有45毫升已经流经组织。注: 如果成功, Glisson 的胶囊应分离的实质或肝脏组织和肝脏本身应该出现无定形。 增加约10毫升的缓冲1到其他结晶皿和放置在鼠标旁边。 取出导管并关闭泵。 用直钳和剪刀, 从老鼠身上切下肝脏。如果胶原酶消化非常有效, 可能需要有一个干净的, 不育的勺子手从老鼠舀肝, 并把它放在缓冲1。 4. 肝细胞纯化 注意: 在无菌组织培养罩中进行细胞的操纵, 以限制细胞在所有后续步骤中的培养。 采用无菌技术, 用镊子抓肝, 轻轻摇动肝细胞。撕裂或拉回 Glisson 的胶囊: 当细胞从肝脏中摇动时, 缓冲会变得不透明。 将细胞溶液倒入50毫升圆锥, 用100µm 过滤器放置在顶部。 增加更多的缓冲1到肝脏残余和继续震动细胞。继续, 直到肝脏似乎没有细胞, 或当未消化的部分肝脏不再产生细胞。 将细胞液倒入另一50毫升圆锥, 其中含有40µm 过滤器。 离心机圆锥在摆动斗转子在 100 x g 3 分钟。注: 不要使用最大刹车, 因为这可能会去除细胞颗粒。使用刹车在 80%, 这是足够的所有剩余的离心步骤在4°c 倒出上清 (含有 npc 和死肝细胞) 成一个干净的圆锥状, 并把它放在冰上。确保这是在一个议案, 以观察颗粒附着。 并用重悬40毫升的缓冲液中的颗粒1。重复步骤4.5 和4.6。并用重悬40毫升的缓冲液中的颗粒3。重复步骤4.5 和4.6 两次。 并用重悬的纯化肝细胞在温暖的 DMEM + 10% 血清 + 2x 青霉素-链霉素 (笔/链球菌)。 如果细胞被培养在胶原涂层板上, 允许他们坚持1小时, 并更换培养基至少一次, 因为这将防止任何新生的细菌污染。 用0.05% 胶原蛋白在0.001% 醋酸中孵化出胶原膜, 至少1小时37摄氏度, 然后用 1x PBS 进行洗涤。 如果肝细胞生存能力低, 并且渴望获得纯化的高活性肝细胞, 那么请使用从克瑞默et al10中适应的以下协议。 混合9卷 pvp 溶液 (Percoll, 23% 瓦特/w 溶液的水和 15-30 纳米胶体二氧化硅粒子涂在 polyvinylpyrrolidone 的密度离心) 和1体积 10x HBSS, 使 iso 渗透 PVP 解决方案 (SIP)。 将24毫升的 SIP 添加到一个不育的50毫升圆锥锥, 可储存在这些条件下长达2月, 在4摄氏度。 将肝细胞浓度调整为 5-10 x 106细胞/mL, 其培养基如步骤4.8 所述。 将25毫升的细胞悬浮液添加到每24毫升含圆锥的 SIP 中, 并通过柔和的反转进行混合。这个溶液的密度是1.06 克/毫升。 离心机圆锥在 50 x g 10 分钟在4°c。 吸入 SIP 和絮凝剂, 并用重悬细胞 HBSS。 通过离心 50 x g 10 分钟, 在4摄氏度清洗细胞。 重复步骤4.10.6 再一次, 然后并用重悬细胞生长培养基。 5. SEC 净化 通过旋转管子在 163 x g 为10分钟, 将上清液中的细胞从步骤4.6 中颗粒化. 将上清液从试管中丢弃, 并并用重悬在5毫升 RPMI 中的所有细胞小球, 不带血清, 并将它们聚集在一根管子中。 一旦所有的颗粒被汇集, 添加 RPMI 到最终的体积35毫升。 离心机的池锥在 25 x g 3 分钟小心地吸入前25毫升的 RPMI 与25毫升吸管, 并放置此媒体包含 npc 在一个干净的50毫升锥形冰。 加入25毫升新鲜 RPMI 回管, 并用重悬颗粒。 重复步骤5.3 第二次清洗和池中清。丢弃剩余的10毫升介质和颗粒 (颗粒主要由死肝细胞组成)。将池上清液离心机 163 x 克, 10 分钟。 在离心过程中, 在50毫升圆锥内准备 PVP 溶液梯度。 添加15毫升 50% PVP 溶液的50毫升圆锥后跟20毫升 25% Percoll 覆盖 pipettor 设置为最慢的弹射速度。一定要观察界定两层的15毫升标记上的折射线, 因为这是秒和 KCs 在离心后会聚集的地方。 并用重悬在10毫升的冷 RPMI 中, 先前在步骤5.5 中颗粒化的细胞, 并将它们覆盖到 PVP 溶液梯度上。确保在两层之间保持明确的分界。离心机的梯度在 805 x g 20 分钟与刹车设置在50%。 从上向下的方向吸入到管子上的20毫升标记上, 然后丢弃这种材料。使用5毫升转移吸管, 收集位于 25/50% 接口上的秒和 KCs。丢弃任何褐色的细胞簇, 因为这些都是死肝细胞。 将细胞放置在50毫升锥形中, 并添加 RPMI 至50毫升标记, 以稀释 PVP 溶液。离心机在 200 x g 10 分钟, 80% 刹车。 在12毫升的温暖 RPMI 中, 吸入并丢弃上清和并用重悬颗粒, 同时洗涤圆锥锥。 将上清放入聚苯乙烯培养皿中, 并在室温下在湿润的组织培养孵化器中孵化8分钟, 将该秒从 KCs 中分离出来。 用25毫升的吸管吸进介质, 用相同的介质冲洗盘子, 以最低的速度 pipettor 设置收集剩余的秒, 而 KCs 坚持板。 离心机秒在 200 x g 10 分钟和并用重悬在 RPMI + 5% 血清 + 笔/链球菌。然后滴下细胞, 并放置在胶原蛋白涂层的文化菜肴。