تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية
概要
والهدف من هذا البروتوكول الحصول على صلاحية عالية وعالية الغلة من خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد. يتم ذلك عن طريق بيرفوسينج في الكبد مع حل نوع كولاجيناز الرابع عن طريق الوريد البابي، متبوعاً بالطرد المركزي التفاضلي للحصول على خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية.
Abstract
هذا البروتوكول يوضح طريقة للحصول على المردود العالي والبقاء للماوس خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية (ثانية) ملائمة لاستزراع أو للحصول على خلية ليساتيس. في هذا البروتوكول، الوريد البابي كالموقع لقسطرة، بدلاً من الوريد الأجوف، كما يحد هذا التلوث بأنواع الخلايا الممكنة الأخرى في إعداد الكبد النهائي. مطلوب لا الأجهزة الخاصة طوال فترة الإجراءات. حمام مائي يستخدم كمصدر للحرارة للحفاظ على درجة الحرارة لكافة المخازن المؤقتة والحلول. يتم استخدام مضخة تمعجية قياسية لمحرك السائل، ومطلوب أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول مبردة لإجراءات الطرد المركزي. القيد الوحيد لهذا الأسلوب هو موضع القسطرة داخل الوريد البابي، الذي يمثل تحديا في بعض من الفئران في نطاق الحجم ز 18-25. ميزة هذا الأسلوب هو أن يستخدم المنوال واحد فقط التروية والوصول إلى هذا السياق السريع، مما يقلل من الاسكيمية وضخه من الكبد يقلل من جدوى الخلية الكبدية. وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أنه من السهل التمييز بين لايف من خلايا الكبد الميت بالبصر بسبب الاختلاف في كثافة الخلوية أثناء خطوات استخدام الطرد المركزي. خلايا من هذا البروتوكول قد تكون المستخدمة في خلية ثقافة لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات، فضلا عن معالجة لأي تقييم البيوكيميائية.
Introduction
وقد أجريت منذ أوائل الخمسينات نضح كولاجيناز في الكبد للحصول على خلايا الكبد وقد تحسنت بشكل مستمر عند1،2،،من34. تم تجميع استعراض لطيفة جداً للعديد من المنهجيات والتقنيات، ووالكواشف المستخدمة في تنقية خلايا الكبد في ماير وآخرون5. الحصول على عائد مرضيا من خلايا الكبد عالية قادرة على البقاء وثانية تحديا من الناحية التقنية. القوات الميكانيكية التي تفصل بين الخلايا بما في ذلك نوعية كولاجيناز هي بعض من المتغيرات التي من الصعب السيطرة عليها. نظراً لحساسية تتمثل بقوى ميكانيكية، يتم تقليل قابليتها ملحوظا في ظروف دون المستوى الأمثل، مما دفع الحاجة إلى بروتوكول وصف الظروف المثلى لعزل. تظهر ثانية من غير أن تكون حساسة للقص الميكانيكية. نضح في الموقع مع الهضم كولاجيناز هو إلى حد بعيد أفضل طريقة لتعطيل الوصلات خلية خلية للحصول على الأعمال التحضيرية خلية مفردة من الكبد والأجهزة الأخرى مثل الأمعاء والطحال6. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة لإدخال المخزن المؤقت التروية في الوريد البابي باستخدام قسطرة بلاستيكية قابل للطي بدلاً من شق التي يمكن أن تسبب الوريد البابي إلى الانهيار، كما هو موضح في Smedsrød وآخرون7.
والهدف من هذه المخطوطة إثبات أهم الخطوات المطلوبة للنجاح في إجراء إسراف الكبد. وتشمل هذه الخطوات موضع القسطرة، تدفق سوائل التروية، والتعامل مع الأنسجة بعد الهضم. معدلات التدفق المعدل فوق المعدل الطبيعي لتدفق الدم، ولكن منخفضة بما يكفي لإبقاء الكبسولة جليسون سليمة. مرة واحدة الكبد يهضم بشكل صحيح ويتم فصل الخلايا في الحل، تنقية خلية بسيطة نسبيا عما إذا كانت تتم بالطرد المركزي التفاضلي، التصاق لوحة، أو بواسطة تنقية حبة المغناطيسية. خلايا الكبد الحية بكثافة أعلى ويتم تنقيتها بسهولة من الخلايا نونبارينتشيمال (الشخصيات) وخلايا الكبد الميت بسرعة بطيئة الطرد المركزي. معظم التطبيقات، التصاق لوحة لفصل كوبفر الخلايا (KCs) وثانية هو أسلوب مشترك8، على الرغم من أن هناك تقارير تفيد بأنها لا تنتج أفضل نقاء ثانية9. KCs لديهم ميل إلى التمسك بالأسطح الصلبة الصلبة بسرعة وأطباق بتري (معيار البوليسترين) هي المواد الأكثر استخداماً لهذا الإجراء. تنقية ثانية أو كيه سي بالاستخدام الأجسام المضادة مترافق المغناطيسي الخرز هو بلا شك أفضل طريقة لتنقية كبيرة من هذه الخلايا، على الرغم من أن الإجراء إضافة آخر 3-4 ح على هذا البروتوكول، وهو العائد الإجمالي انخفضت9. يوضح هذا التقرير بالتفصيل عملية نضح كبد مثلى التي عادة ما تسفر عن عدد مرتفع من خلايا قابلة للحياة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويبرز هذا البروتوكول بالأدوات المتوفرة والتي ستتيح للمستخدم نسبة عالية من النجاح في هذا الإجراء. نضح ناجحة أمر أساسي لأي تطبيق المصب عند العمل مع الخلايا الأولية.
وهناك بضع خطوات حاسمة من الإجراءات التي تحدد النجاح. أولاً، يجب أن يكون وضع طرف قسطرة داخل الوريد البابي الصحيح. إذا وضعت بعيداً جداً داخل الكبد، وسوف perfused الفصوص طفيفة فقط. يجب أن تكون الحافة فقط أدناه فروع الوريد البابي الأيمن والأيسر. ميزة استخدام قسطرة مركب البوليمر عبر إبرة أن بارب الإبرة المسيل للدموع على المنوال خلال نضح من قسطرة على الأرجح. ثانيا، تحديد كمية ونوعية كولاجيناز كفاءة الهضم الكبد. في هذا الإجراء، واستخدمت كولاجيناز المؤهلين مسبقاً نوع 4 وأنه هو حراكه في 0.5 ملغ/مل في المخزن المؤقت 2 إذا كان النشاط كولاجيناز تكون جزيئي أكبر من 900 وحدة دولية.
في نهاية نضح كولاجيناز، ينبغي أن تحتفظ الكبد تان مظلمة إلى حد ما إلى اللون البنى. إذا كان لون تان ضوء، ثم خلايا الكبد معظم القتلى. الكبد وينبغي أن تكون تتهاوى عندما قطعت من الماوس. في أفضل الظروف، قد يكون حصد الكبد خارج تجويف الجسم للماوس مع ملعقة صغيرة. كبد في هذا الشرط دائماً إعطاء صلاحية خلية عالية جداً. إذا كان الأمر يستغرق الكثير من الجهد لاهتزاز الخلايا عن بعضها البعض، إذا ما زال راسخا الكبد أثناء استخراج، أو إذا كان هناك الكثير من القوة اللازمة للتحرك في خلايا الكبد من خلال المرشحات، ثم خلايا الكبد سيكون صلاحية أقل. خلايا الكبد مغطاة زغيبات، مما يسمح لهم بمساحة سطحية عالية جداً (الشكل 10). غير مكتملة الهضم يحتفظ خلية خلية الوصلات بين خلايا الكبد، والقص الميكانيكية سوف تمزق غشاء البلازما. نضح في الموقع مع كولاجيناز هو أفضل طريقة للتفكك من الخلايا والمحافظة على سلامة عالية. في الشكل 11، قورنت اثنين تتمثل الاستعدادات في الذي الكريات الخلية بعد قليل يغسل في المخزن المؤقت 1. بيليه على اليسار أخف ويحتوي على بقاء خلية حوالي 50%. بيليه على اليمين أغمق وجدوى من 92 في المائة. وبالمثل، عند سكب السائل من 50 مل المخروطية، ثابتة داخل الأنبوب، على عكس بيليه أخف، الذي سوف الشريحة في الأنبوب كما سكب السائل قبالة بيليه أكثر قتامة. بقاء الخلية السفلي أو بيرفوسيونس غير فعالة قد تحدث عندما الكبد يحتوي على مستويات عالية من التصلب.
منذ خلايا الكبد الحية لها كثافة أعلى من خلايا الكبد الميت، سيؤدي إلى إجراءات الطرد المركزي استعدادا نقية جداً في خلايا الكبد سليمة15. إذا لم يكن هناك كمية كبيرة من خلايا الكبد الميت (الذي غالباً ما يحدث عندما تكون الشروط الأمثل)، يعيش الخلايا قد تكون زيادة إثراء وفصلها عن الخلايا الميتة باستخدام التدرجات حماية الأصناف النباتية. منذ خلايا الكبد الحية بيليه أسرع من خلايا الكبد الميت، بالإضافة إلى ذلك، سوف أيضا زيادة نسبة مباشرة إلى الخلايا الميتة في بيليه التطلع للأعلى 3rd لبيليه. تكون هذه الإجراءات سريعة وطرق سهلة لفصل مباشر من خلايا الكبد الميت وخلية الحطام عند الحاجة10،16. وهذا مفيد بشكل خاص إذا كانت العينة الثمينة، وفقط عدد قليل من الخلايا مليون مطلوبة للتجربة.
وفي الختام، وهذا طريقة سهلة وفعالة لحصاد خلايا الكبد وثانية من الكبد. بالأسعار الحالية، هو تكلفة القيام بهذا الإجراء بما في ذلك جميع الكواشف ومرة واحدة تحت 75 دولاراً لكل إعداد. إذا هي رغبت في الفئران متعددة، فمن الأفضل المضي قدما في تنقية تتمثل وإبقاء الكسر نواب على الجليد حتى تم تجهيز جميع الفئران. الشخصيات مستقرة بصفة عامة على الجليد لمالا يقل عن 5 ح، ولكن لم يتم اختبارها لأوقات أطول في هذا المختبر.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقدم التمويل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة من المنحة R01HL130864.
Materials
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100×50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | コメント |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
参考文献
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. . The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
