Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.
La capacidad de estudiar la génesis de células madre hematopoyéticas (HSC) durante el desarrollo embrionario ha sido limitada por la rareza de los precursores HSC en el embrión y la falta de ensayos que identifican funcionalmente el potencial a largo plazo del engraftment del multilineage de los supuestos precursores HSC. Aquí, describimos la metodología que permite el aislamiento y caracterización de precursores HSC funcionalmente validados a nivel unicelular. En primer lugar, utilizamos índice de clasificación para catalogar el parámetro fenotípico precisa de cada célula individualmente seleccionada, utilizando una combinación de marcadores fenotípicos para enriquecer de precursores HSC con marcadores adicionales para análisis experimental. En segundo lugar, cada célula ordenadas de índice es co cultivada con estroma nicho vascular de la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM), que apoya la maduración de los precursores de HSC no engrafting funcional HSC con el engraftment del multilineage, a largo plazo potencial en ensayos de trasplante. Esta metodología permite la correlación de propiedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal con su potencial de funcional engraftment u otras propiedades como perfil transcripcional, proporcionar un medio para el análisis detallado del precursor HSC desarrollo a nivel unicelular.
Estudios clonales han revelado heterogeneidad en las propiedades a largo plazo del engraftment de adultos HSCs, proporcionar la nueva penetración en subtipos de HSC y cambios en el comportamiento HSC durante envejecimiento1. Sin embargo, estudios similares de HSCs embrionarias y sus precursores han sido más difícil. Durante el desarrollo embrionario temprano, HSCs surgen de una población de precursores conocido como endotelio hemogenic en un proceso transitorio que se refiere como endoteliales hematopoyético transición2. El primer HSC, definido por su capacidad para proporcionar engraftment del multilineage robusto, a largo plazo después del trasplante en recipientes adultos condicionados, no se detectan hasta después del día embrionario 10.5 (E10.5) en el embrión murino, en muy baja frecuencia3 . Durante su desarrollo, precursores de HSC (pre-HSC) derivados de endotelio hemogenic deben sufrir maduración antes de adquirir las propiedades de HSC adultos que permiten la eficiente injerto en trasplante ensayos4,5 , 6. oscurecimiento el estudio del origen HSC rara, una multitud de progenitores hematopoyéticos con eritroides, potencial mieloide y linfoide ya se detectan antes de la aparición de HSC de pre-HSC7,8. Así, la distinción pre-HSC de otros progenitores hematopoyéticos exige métodos clonally aislar células y les proporcione las señales suficientes para su maduración a HSC, para detectar sus propiedades engraftment en los ensayos de trasplante.
Ha descrito una serie de enfoques que permiten la detección de pre-HSC por maduración en vivo o ex vivo a HSC. Métodos ex vivo han dependido de la cultura de los tejidos embrionarios, como la región AGM, donde el primer HSC se detectan en el desarrollo9. Basándose en estos métodos, protocolos que incorporan la disociación, clasificación y la agregación de tejidos AGM han permitido la caracterización de poblaciones ordenadas que contienen precursores HSC durante el desarrollo de E9.5 en E11.5 en los para-aórticos Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiones4,5,10; sin embargo, estos planteamientos no son susceptibles de análisis de alto rendimiento de precursores a nivel unicelular para análisis clonal. Del mismo modo, en vivo la maduración de transplante en ratones recién nacidos, donde el microambiente se presume que es más conveniente para el apoyo de las anteriores etapas de precursores HSC, ha permitido estudios de poblaciones ordenadas desde el saco vitelino y AGM / P-Sp (P-Sp es la región del precursor a la AGM) con características de pre-HSC, pero estos métodos también proporcionan una sólida plataforma para el solo, no de la célula análisis11,12.
Estudios de Rafii et al demostraron que estroma Akt activa la célula endotelial (CE) puede proporcionar un substrato de nicho para el apoyo de adultos HSC auto-renovación en vitro13,14,15. Recientemente se determinó que Akt activa CE derivada de la región AGM (AGM-CE) proporciona un nicho adecuado en vitro para la maduración de precursores hemogenic, aislado desde E9 en desarrollo, a HSC engrafting adulto, así como la posterior auto renovación de HSC generado16. Dado que este sistema emplea una simple cultura de CO 2-dimensional, es fácilmente adaptable para análisis clonal del potencial HSC de precursores hemogenic individualmente aislados.
Recientemente hemos reportado un acercamiento al análisis del potencial HSC de precursores hemogenic clonal combinando índice clasificación de individuales hemogenic precursores de embriones murinos con cocultivo AGM-CE y posterior análisis funcional en el trasplante ensayos de17. Índice de clasificación es un modo de activar la fluorescencia de la célula clasificación (FACS) que registra (índices) todos parámetros fenotípicos (es decir, parámetros de fluorescencia de forward scatter (FSC-A), lado scatter (SSC-A),) de cada célula individual ordenado tal que estos características pueden correlacionarse retrospectivo para posterior análisis funcional tras la clasificación. Software de FACS registra tanto información fenotípica cada celda y la posición/de la placa de 96 pozos en que se colocó. Esta técnica se ha utilizado anteriormente con elegancia para identificar heterogeneidad en HSC adultos, determinar parámetros fenotípicos que más enriquecen para el subconjunto engrafting a largo plazo de HSC y correlacionan los parámetros fenotípicos de HSC con transcripcional propiedades a la sola célula nivel18,19. Aquí, ofrecemos una metodología detallada de este enfoque que permite la identificación de parámetros fenotípicos únicos y las contribuciones de linaje de pre-HSC durante etapas tempranas del desarrollo embrionario.
El estudio de la génesis de la HSC durante el desarrollo embrionario requiere medios para detectar posible precursores de hemogenic aún falta la competencia para proporcionar a largo plazo del multilineage reconstitución hematopoyética en recipientes adultos trasplantados de HSC. En este protocolo, presentamos un ensayo clonal de precursores hemogenic embrionario por co-cultivo stromal vascular nicho ECs de la Junta General, que apoya la maduración de los precursores de HSC, con posterior análisis funcional en los …
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Andrew Berger, Stacey Dozono y Brian Raden en el Fred Hutchinson flujo Cytometry núcleo de asistencia con FACS. Este trabajo fue apoyado por la beca de los institutos nacionales de salud NHLBI UO1 #HL100395, auxiliares Collaborative Grant #HL099997 y NIDDK conceden #RC2DK114777. Brandon Hadland es apoyado por el Alex Lemonade Stand Foundation y Hyundai Hope sobre ruedas Fundación.
AGM-EC culture media | |||
Materials for culture of endothelial cells | |||
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
AGM-EC culture media (500 mls) | |||
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
Materials for AGM index sort | |||
Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
Antibodies for AGM index sort | |||
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
AGM-serum free media (10mls) | |||
X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
Materials for Staining co-cultured cells | |||
96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
Materials for tail vein injection for transplant | |||
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
Equipment | |||
BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |