概要

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

Published: May 08, 2018
doi:

概要

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

Abstract

היכולת ללמוד תאי גזע hematopoietic (HSC) בראשית במהלך התפתחות עובריים יש היה מוגבל על-ידי בנגישות של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי ב העובר מוקדם והיעדר מבחני שמזהים את הפוטנציאל multilineage engraftment לטווח ארוך של פונקציונלית בודדים בשם HSC סימנים מקדימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המאפשרת את בידוד ואפיון של מבשרי HSC מאומתים באופן פונקציונלי ברמת תא בודד. ראשית, אנו מנצלים אינדקס מיון לקטלוג הפרמטר פנוטיפי מדויק של כל תא בנפרד ממוינים, באמצעות שילוב של סמנים פנוטיפי להעשיר עבור מועדון הכדורגל מונפלייה סימנים מקדימים עם סמנים נוספים עבור ניתוח ניסיוני. שנית, כל תא ממוין אינדקס הוא תרבותי משותף עם נישה וסקולרית משתית מאזור (AGM) אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros, אשר תומכת ההבשלה של הלא-engrafting מועדון הכדורגל מונפלייה המבשרות על HSC פונקציונלי עם פוטנציאל multilineage, לטווח ארוך engraftment מבחני השתלת. מתודולוגיה זו מאפשרת המתאם המאפיינים פנוטיפי של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים עם הפוטנציאל שלהם engraftment תפקודית או מאפיינים אחרים כגון פרופיל תעתיק, מתן אמצעים לניתוח מפורט של מועדון הכדורגל מונפלייה קודמן פיתוח ברמה תא בודד.

Introduction

המשובטים מחקרים גילו הטרוגניות במאפיינים engraftment לטווח ארוך של HSCs למבוגרים, לספק תובנה חדשה HSC יחוברו ושינויים בהתנהגות HSC במהלך ההזדקנות1. עם זאת, מחקרים דומים של HSCs עובריים ו מבשרי שלהם כבר יותר מאתגר. במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, HSCs נובעים אוכלוסיה של סימנים מקדימים המכונה hemogenic אנדותל בתהליך ארעי התייחס כאל אנדותל המעבר hematopoietic2. הראשונה מועדון הכדורגל מונפלייה, שהוגדרו על-ידי היכולת שלהם לספק engraftment multilineage חזקות, לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך נמענים למבוגרים ממוזגים, לא מזוהים עד לאחר יום עובריים 10.5 (E10.5) בהעובר מאתר, תדירות נמוכה מאוד3 . במהלך התפתחותם, המבשרות על מועדון הכדורגל מונפלייה (pre-HSC) הנובעות hemogenic אנדותל חייב לעבור התבגרות לפני רכישת מאפייני HSC למבוגרים המאפשרים engraftment יעיל השתלת מבחני4,5 , 6. פגיעה ביעילות המחקר ממוצא HSC נדירים, שפע של אבות hematopoietic עם erythroid, פוטנציאל מיאלואידית, ו הלימפה כבר זוהו לפני ייסודה של מועדון הכדורגל מונפלייה טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה7,8. לפיכך, שיסייעו לך לייחד טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה אבות hematopoietic אחרים דורש שיטות clonally בידוד תאי, לספק להם האותות מספיק עבור ההבשלה שלהם כדי HSC, לזהות את המאפיינים engraftment שלהם מבחני השתלת.

מספר גישות תוארו המאפשרות איתור קדם-מועדון הכדורגל מונפלייה על ידי התבגרות או ex-vivo או vivo כדי HSC. שיטות שמחוץ היו תלויים תרבות של רקמות עובריים, כגון האזור AGM, איפה מועדון הכדורגל מונפלייה הראשון מזוהים פיתוח9. על שיטות אלה, פרוטוקולים אשר משלבות את הדיסוציאציה, מיון של צבירת מחדש של רקמות AGM התירו אפיון אוכלוסיות ממוינים המכיל HSC מבשרי במהלך הפיתוח מ E9.5 ל E11.5 ב פארא-ותיני splanchnopleura (P-Sp) / AGM אזורים4,5,10; עם זאת, גישות אלה אינם לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של סימנים מקדימים ברמת תא בודד נדרש לניתוח המשובטים. באופן דומה, אין ויוו ההבשלה על ידי השתלת לתוך עכברים היילוד, איפה microenvironment המשוער יהיה מתאים יותר התמיכה של שלבים מוקדמים של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי, איפשר גם מחקרים על אוכלוסיות ממוינים מן החלמון AGM / P-Sp (P-Sp הוא האזור קודמן כדי ומזכיר האסיפה) עם מאפיינים של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה, אבל השיטות האלה גם להיכשל כדי לספק פלטפורמה חזקה ליחיד תא ניתוח11,12.

לימודי Rafii. et al. הפגינו שאת משתית תא אנדותל לפעיל על-Akt (EC) מספקים מצע נישה עבור התמיכה של מבוגרים HSC התחדשות עצמית במבחנה13,14,15. אנחנו נקבע לאחרונה כי מופעל Akt EC נגזר מן האזור AGM (AGM-EC) מספק משרה מתאימה במבחנה ההבשלה של מבשרי hemogenic, מבודד מוקדם ככל E9 בפיתוח, כדי engrafting למבוגרים מועדון הכדורגל מונפלייה, כמו גם עוקבות התחדשות עצמית של מועדון הכדורגל מונפלייה שנוצר16. נתון כי מערכת זו מעסיקה תרבות משותפת 2-ממדי פשוטה, זה בקלות להתאמה לניתוח המשובטים של הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic מבודדים בנפרד.

לאחרונה דיווחנו גישה assay הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים על-ידי שילוב מדד מיון של סימנים מקדימים hemogenic בודדים מעוברים מאתר עם תרבות משותפת AGM-EC, אנליזה פונקציונלית הבאים בהשתלת מבחני17. אינדקס מיון הוא תא מצב של לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) את הרשומות (אינדקסים) כל הפרמטרים פנוטיפי (קרי, פיזור קדמי (FSC-A), לצד פיזור (האס-A), קרינה פלואורסצנטית פרמטרים) של כל תא בנפרד ממוינים כזה אלו תכונות ישויך retrospectively כדי שלאחר מכן אנליזה פונקציונלית בעקבות מיון. תוכנה FACS רשומות הן מידע פנוטיפי עבור כל תא, הבאר/המיקום של צלחת 96-ובכן בו היא מוצבת. טכניקה זו בעבר שימש באלגנטיות כדי לזהות הטרוגניות במועדון הכדורגל מונפלייה למבוגרים, לקבוע פרמטרים פנוטיפי נוספת להעשיר עבור המשנה engrafting לטווח ארוך של מועדון הכדורגל מונפלייה, לתאם את הפרמטרים פנוטיפי של מועדון הכדורגל מונפלייה עם תעתיק מאפיינים-הסינגל תא רמה18,19. כאן, אנו מספקים נתונים היסטוריים מתודולוגיה של גישה זו, אשר מאפשרת זיהוי של פרמטרים ייחודיים פנוטיפי ו שושלת היוחסין תרומות של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה בשלבים המוקדמים של התפתחות.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פרד האצ’ינסון לחקר הסרטן. 1. הכנת AGM-EC Monolayers לתרבות משותפת 24 שעןת לפני ניתוח AGM ומיון, להפוך AGM-EC תרבות המדיה מסנן לחטא. להוסיף ג’לטין 0.1% במים (100 µL טוב) כל טוב של צלחת 96-ובכן דגירה בטמפר?…

Representative Results

איור 1A מראה סכימטי של הנבחנים. פעם אחת P-Sp/AGM רקמות הם גזור, איחדו ולאחר הפומבית של collagenase, הם מוכתמים נוגדנים VE-קדהרין, EPCR למיון אינדקס. Pre-מועדון הכדורגל מונפלייה מועשרים בתאים ממוינים VE-קדהרין+EPCRגבוהה (איור 1B). נוגדנים fluorochrome מצו…

Discussion

המחקר של מועדון הכדורגל מונפלייה בראשית במהלך התפתחות עובריים מחייבת אמצעי לגילוי HSC פוטנציאל מבשרי hemogenic עדיין חסר את היכולת לספק הכינון hematopoietic multilineage לטווח ארוך ב המושתלים נמענים למבוגרים. פרוטוקול זה, אנו מציגים וזמינותו המשובטים של סימנים מקדימים hemogenic עובריים מאת סטרומה תרבות משותפ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות אנדרו ברגר, סטייסי Dozono, בריאן Raden פרד האצ’ינסון Flow Cytometry הליבה לקבלת סיוע עם FACS. עבודה זו נתמכה על ידי המענק נבחרת מוסדות של בריאות NHLBI UO1 #HL100395, נלווים-שיתופי גרנט #HL099997, NIDDK הענק #RC2DK114777. ברנדון Hadland נתמך על ידי אלכס של לימונדה לעמוד קרן ותקווה יונדאי על בסיס גלגלים.

Materials

AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

参考文献

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Play Video

記事を引用
Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

View Video