Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung¹. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang². Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditionierten Erwachsenen Empfänger werden nicht erkannt, erst nach embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der murinen Embryo bei sehr niedrigen Frequenz³ . Während ihrer Entwicklung müssen Vorläufer des HSC (Pre-HSC) aus Hemogenic Endothel unterziehen Reifung vor dem Immobilienerwerb von Erwachsenen HSC die ermöglichen effiziente Engraftment Transplantation Assays^{4,5 , 6}. verdeckt das Studium der seltenen HSC Herkunft, eine Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit erythroiden, myeloischen und lymphatischen Potenzial werden schon vor der Entstehung des HSC von Pre-HSC^7,8erkannt. Pre-HSC von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu unterscheiden erfordert daher Methoden klonal Zellen zu isolieren und Ihnen mit den Signalen ausreichend für ihre Reifung, HSC, um ihre Engraftment Eigenschaften in Transplantation Assays zu erkennen.

Eine Reihe von Ansätzen sind beschrieben worden, die für den Nachweis von Pre-HSC von ex-Vivo oder in Vivo Reifung, HSC ermöglichen. Ex-Vivo -Methoden sind angewiesen, auf die Kultur der embryonalen Gewebe, wie z. B. der AGM-Region, wo die ersten HSC in Entwicklung⁹erkannt werden. Aufbauend auf diese Methoden, Protokolle, die die Dissoziation zu integrieren haben sortieren und Re-Aggregation von AGM Geweben die Charakterisierung der sortierten Populationen mit HSC Vorläufer bei der Entwicklung von E9.5 zu E11.5 in der Para-aortalen zulässig Splanchnopleura (P-Sp) / AGM Regionen^4,5,10; Allerdings sind diese Ansätze nicht zugänglich Hochdurchsatz-Analyse der Vorläufer der Ebene der Einzelzelle für klonale Analyse erforderlich. In ähnlicher Weise in Vivo Reifung durch Transplantation in Neugeborene Mäuse, wo der Mikroumgebung vermutlich besser geeignet für die Unterstützung der früheren Phasen des HSC Vorstufen, ermöglichten auch Studien der sortierten Bevölkerungen aus dem Dottersack und AGM / P-Sp (P-Sp ist die Vorläufer-Region zur Hauptversammlung) mit Merkmalen der Pre-HSC, aber diese Methoden auch scheitern, eine robuste Plattform für einzelne Zelle Analyse^11,12.

Studien von Rafii Et Al. haben gezeigt, dass dieser Akt aktiviert Endothelzellen (EG) Stroma eine Nische Substrat für die Unterstützung von Erwachsenen HSC Selbsterneuerung in-vitro-^13,14,15bieten kann. Wir entschlossen vor kurzem, dass Akt aktiviert EG abgeleitet aus der AGM-Region (AGM-EC) eine geeignete in-vitro- Nische für die Reifung der Hemogenic Vorläufer bietet, so früh wie E9 in Entwicklung, für die Erwachsenen Einpflanzen HSC sowie die anschließende isoliert Selbsterneuerung der generierten HSC¹⁶. Angesichts der Tatsache, dass dieses System eine einfache 2-dimensionale kokultur beschäftigt, ist es leicht anpassbar für klonale Potenzialanalyse der HSC einzeln isolierten Hemogenic Grundstoffe.

Vor kurzem haben wir ein Konzept für die HSC-Potenzial der klonalen Hemogenic Vorstufen assay durch die Kombination von Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen aus murinen Embryonen mit AGM-EG Kokulturen und anschließenden Funktionsanalyse in der Transplantation berichtet. ¹⁷Tests. Index zu sortieren ist eine Art der Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), die Datensätze (Indizes) alle phänotypischen Parameter (d.h., forward Scatter (FSC-A), Side Scatter (SSC-A), Fluoreszenz Parameter) jeder einzeln sortierten Zelle so, dass diese Funktionen können rückwirkend mit anschließenden Funktionsanalyse nach Sortierung korreliert werden. FACS-Software zeichnet sowohl phänotypische Informationen für jede Zelle und die Position/gut von den 96-Well-Platte, in die sie gestellt wurde. Diese Technik wurde bisher elegant zur erkennen Heterogenität in Erwachsenen HSC, phänotypische Parameter, die weiter für die langfristige anwachsen Teilmenge der HSC zu bereichern, und phänotypischen Parameter des HSC mit transkriptionelle korrelieren Eigenschaften auf die einzelne Zelle Ebene^18,19. Hier bieten wir detaillierte Methode dieses Ansatzes, die Identifikation der einzigartigen phänotypischen Parameter und Abstammung Beiträge von Pre-HSC in frühen Phasen der Embryonalentwicklung ermöglicht.