概要

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Published: May 08, 2018
doi:

概要

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Abstract

De mogelijkheid te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) genesis tijdens de embryonale ontwikkeling heeft is beperkt door de zeldzaamheid van HSC precursoren in het vroege embryo en het ontbreken van tests waarmee functioneel het lange termijn potentieel van de multilineage engraftment van individuele putatief HSC precursoren. Hier beschrijven we een methodologie waarmee de isolatie en de karakterisering van functioneel gevalideerde HSC precursoren op het niveau van één cel. Ten eerste, wij gebruiken index Sorteren om de precieze fenotypische parameter van elke cel afzonderlijk gesorteerde winkel met behulp van een combinatie van fenotypische markers te verrijken voor HSC precursoren met extra markeringen voor experimentele analyse. Ten tweede, elke index-gesorteerd op cel is mede gekweekte met vasculaire niche stroma uit de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio, die ondersteunt de rijping van niet-enten HSC voorlopers van functionele HSC met multilineage, op de lange termijn engraftment potentieel in transplantatie testen. Deze methode maakt een correlatie van fenotypische eigenschappen van klonen hemogenic precursoren met hun functionele engraftment potentieel of andere eigenschappen zoals transcriptionele profiel, het verstrekken van een middel voor de gedetailleerde analyse van de voorloper van de HSC ontwikkeling op het niveau van één cel.

Introduction

Klonen studies is gebleken heterogeniteit in de lange termijn engraftment eigenschappen van volwassen HSCs, nieuwe inzicht bijbrengen in HSC subtypen en wijzigingen in de HSC gedrag tijdens veroudering1. Echter, soortgelijke studies van embryonale HSCs en hun uitgangsstoffen zijn uitdagender. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, HSCs die ontstaan is uit een populatie van precursoren bekend als hemogenic endotheel in een voorbijgaande proces bedoeld als het endotheel hematopoietische overgang2. Het eerste HSC, gedefinieerd door hun vermogen om te leveren robuuste, op lange termijn multilineage engraftment na transplantatie in geconditioneerde volwassen geadresseerden, worden niet gedetecteerd totdat na embryonale dag 10.5 (E10.5) in het lymfkliertest embryo, met zeer lage frequentie3 . Tijdens hun ontwikkeling, moeten voorlopers van HSC (pre-HSC) die voortvloeien uit hemogenic endotheel rijping voorafgaand aan het verwerven van de eigenschappen van volwassen HSC die voorzien in efficiënte engraftment in4,5 van de tests van de transplantatie ondergaan , 6. de studie van zeldzame HSC oorsprong, een veelheid van hematopoietische progenitorcellen met erythroid, verduisterend myeloïde en lymfoïde potentieel al worden gedetecteerd vóór de opkomst van HSC van pre-HSC7,8. Pre-HSC onderscheiden van andere hematopoietische progenitorcellen vereist dus, methoden voor klonaal cellen isoleren en hen voorzien van voldoende voor hun rijping signalen naar HSC, om te ontdekken hun engraftment eigenschappen in het testen van de transplantatie.

Een aantal benaderingen zijn beschreven die voldoende zijn voor de detectie van pre-Help en ondersteuning door ex vivo of in vivo rijping naar HSC. Ex vivo methoden hebben afhankelijk van de cultuur van embryonale weefsels, zoals de AGM-regio, waar het eerste HSC in ontwikkeling9worden gedetecteerd. Voortbouwend op deze methoden, protocollen waarin de dissociatie opgenomen, hebben sorteren, en opnieuw aggregatie van AVA weefsels toegestaan de karakterisatie van gesorteerde populaties met HSC precursoren tijdens de ontwikkeling van E9.5 naar E11.5 in de para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regio’s4,5,10; deze benaderingen zijn echter niet vatbaar voor high-throughput analyse van precursoren op het niveau van de eencellige vereist voor klonen analyse. Ook in vivo rijping door transplantatie in pasgeboren muizen, waar de communicatie wordt geacht te zijn meer geschikt voor de ondersteuning van eerdere fasen van HSC precursoren, ook heeft onderzoek van gesorteerde populaties van de dooierzak en AVA / P-Sp (P-Sp is de regio van de voorloper van de AVA) met kenmerken van pre-HSC, maar deze methoden ook niet te voorzien van een robuust platform voor single cell analysis11,12.

Studies van Rafii et al. aangetoond dat Akt-geactiveerde endothelial cel (EG) stroma kan bieden een niche-substraat voor de ondersteuning van volwassen HSC zelf-vernieuwing in vitro13,14,15. We onlangs vastgesteld dat Akt-geactiveerde EG afgeleid van de AVA regio (AGM-EG) een niche geschikt in vitro voor de rijping van hemogenic precursoren biedt, zo vroeg als E9 in ontwikkeling, tot volwassene-enten HSC, evenals de latere geïsoleerd zelf-vernieuwing van de gegenereerde HSC16. Gezien het feit dat dit systeem maakt gebruik van een eenvoudige CO 2-dimensionale cultuur, is het gemakkelijk aanpasbaar voor klonen analyse van het potentieel van de HSC van individueel geïsoleerde hemogenic precursoren.

We hebben onlangs gemeld dat een benadering van het potentieel van de HSC van klonen hemogenic precursoren assay door het combineren van index sortering van individuele hemogenic precursoren van lymfkliertest embryo’s met AGM-EG mede cultuur en latere functionele analyse van transplantatie testen van17. Het sorteren van de index is een modus van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) dat records (indexen) alle fenotypische parameters (d.w.z., voorwaartse scatter (FSC-A), naast scatter (WS-A), fluorescentie parameters) van elk afzonderlijk gesorteerde cel dat deze functies kunnen met terugwerkende kracht worden gecorreleerd aan latere functionaalanalyse na sorteren. FACS software registreert beide fenotypische informatie voor elke cel en de positie per putje van de 96-wells-plaat waarin het werd geplaatst. Deze techniek is eerder elegant gebruikt voor het identificeren van heterogeniteit in volwassen HSC, fenotypische parameters die verder verrijken voor de lange termijn enten subset van HSC, en fenotypische parameters van HSC correleren met transcriptionele bepalen eigenschappen op de single cell niveau18,19. Hier, bieden wij gedetailleerde methodologie van deze aanpak waarmee identificatie van unieke fenotypische parameters en bloedlijn bijdragen van pre-Help en ondersteuning tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het Fred Hutchinson Cancer Research Center. 1. bereiding van de AVA-EG Monolayers co cultuur 24 uur voorafgaand aan de AVA dissectie en sorteren, maken AVA-EG cultuurmedia en filter steriliseren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten Aspirate de gelatine, 0,1% gelatine in water (100 µL per putje) toevoegen aan elk putje van een 96-wells-p…

Representative Results

Figuur 1A blijkt een schematische voorstelling van de proefopzet. Zodra P-Sp/AGM weefsels zijn ontleed, gebundeld en losgekoppeld in collagenase, zijn ze gekleurd met antilichamen tegen VE-cadherine en EPCR voor het sorteren van de index. Pre-HSC zijn verrijkt met cellen gesorteerd op VE-cadherine+EPCRhoge (figuur 1B). Andere fluorescerende-geconjugeerde antilichamen kunnen worden opgenomen om te analyseren …

Discussion

De studie van HSC genesis tijdens de embryonale ontwikkeling vereist kunnen detecteren HSC potentiële in hemogenic precursoren nog ontbreekt de bevoegdheid om te bieden op de lange termijn multilineage hematopoietische reconstitutie in getransplanteerde volwassen ontvangers. In dit protocol presenteren we een klonale assay van embryonale hemogenic precursoren door stromale co cultuur op vasculaire niche ECs van de AVA, die de rijping van precursoren naar HSC ondersteunt, met latere functionele analyse van transplantatie…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken Andrew Berger, Stacey Dozono en Brian Raden in het Fred Hutchinson Stroom Cytometry kern voor hulp met FACS. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid NHLBI UO1-subsidie #HL100395, bijkomende Collaborative Grant #HL099997 en NIDDK verlenen #RC2DK114777. Brandon Hadland wordt ondersteund door de Alex’s limonade staan Foundation en Hyundai Hope op wielen Foundation.

Materials

AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

参考文献

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Play Video

記事を引用
Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

View Video