人肠道 Organoids 上皮屏障通透性的实时测量

正常, 去除人类成人肠道组织是从已故器官捐献者通过生命的礼物, 密歇根州。人类 ES 细胞系 H9 (NIH 注册 #0062) 是从 WiCell 研究所获得的。这项工作中使用的所有人体组织都是从非活体捐赠者那里获得的, 是去除的, 并得到了密歇根大学 IRB (协议号 HUM00093465 和 HUM00105750) 的批准。 1. 微量设置 获取材料表中列出的材料。 在生物安全柜中放置微、解剖范围和光源。在实验前用70% 乙醇或其他消毒剂清洗微注射装置。避免长期接触含有漂白剂的消毒剂, 这可能会腐蚀微注射设备。注意: 一个完整的微量程序集的示例如图 1所示。 定位解剖范围, 使眼片可以通过在盾牌的安全柜中的进入端口使用。 另外, 使用具有正气流系统的干净的工作台代替具有显微镜接入点的生物安全柜。 根据制造商的说明, 在显微镜的右侧装配微, 并进行调整, 以便可以轻松地达到和调整控制。微应安装在铁盘上或以其他方式稳定。注意: 左撇子用户可能希望将微放在解剖范围的左侧。 将微支架安装到微臂上, 并将模拟油管插入微支架。 用大约 5-7 毫升的无菌矿物油填充10毫升玻璃注射器。 使用口锁机构将10毫升的含矿物油的玻璃注射器连接到模拟油管的开口端。将玻璃注射器放在解剖范围的左侧, 与微。 轻轻地压低注射器, 通过油管推动矿物油。将大约10滴矿物油从微持有者的尖端冲出, 并在培养皿或类似容器中收集并丢弃。注: 此步骤将从油管中除去所有空气, 并在每次微注射前进行。 2. 显微注射的制备 注射前24小时: 用 re-suspending FITC 葡聚糖制备 FITC 葡聚糖溶液, 在无菌 PBS 或盐水中浓度为2毫克/毫升。准备 #62 的总容量; 250 µL。注: 可使用高或低浓度的 FITC 葡聚糖, 范围从大约 0.1-10 毫克/毫升。调整 FITC 葡聚糖的浓度以适应下游的成像应用。 设置化文化在4或8井玻璃室幻灯片或其他文化船适合实况显微镜, 与 4-6 HIOs 每井, 嵌入50µL 细胞基质溶液和培养 EGF, 脑袋和 R-Spondin (ENR) 生长因子媒体19 ,24。在 real-time 成像分析过程中, 注意 organoids 均匀地 (大约5毫米) 的空间, 以避免在单个显微镜场中捕获多个 HIOs。有关 HIO 文化和维护的完整指南, 请参阅 McCraken et al.24。注: 本协议是利用干细胞衍生的 HIOs 和代表性的结果 (见下文) 证明了这种组织培养模型的使用。然而, 同样的协议很容易适应组织衍生肠上皮 organoids15,29。组织衍生 HIOs 通常小于 PSC 衍生的 HIOs 和缺乏支持的间充质侧细胞结构15,29,30。注射组织衍生 HIOs 可能需要更大程度的技术能力和经验。利用组织衍生的 HIOs 获得的上皮屏障通透性数据的程度与 hPSC 衍生的 HIOs 是未知的。 孵育 HIOs 在标准细胞培养孵化器在42° c 和 5% CO2在微注射之前。 注射前30分钟, 打开生物安全柜, 将玻璃防护罩提升至最佳工作高度。 从生物安全柜中取出所有不必要的物品。杂波增加了在密闭空间工作时溢漏或其他事故的风险。 用70% 乙醇或其它消毒剂喷洒和彻底清洁工作表面。用纸巾擦拭干净。 检查附着在微量上的玻璃注射器中的矿物油水平。如果剩余的矿物油少于3毫升, 拧开注射器, 在生物安全柜内重新填充, 小心避免引入气泡。不要填充超过7毫升。 打开灯照亮解剖范围。调整目镜的个人舒适性。 将微定位到解剖范围的右侧。使用磁性支架将微固定在铁板上。将磁立场切换到 OFF 位置, 以调整微的位置, 并通过将磁性支架设置到 ON 位置来将支架固定在铁板上。 Microcapillary 安装 从制造商提供的存储容器中检索单个 1 mm 的玻璃灯丝。 将玻璃纤维通过微拉拔器的铜加热线圈的中心插入。注意: 有关准备微拉出器的指南, 请参见图 2 。 位置的灯丝, 使铜加热线圈大约在中间的玻璃灯丝。这将确保拉拔器产生两个可用的注射针头从每个玻璃灯丝。 先拧紧顶夹, 确保玻璃灯丝在缺口树丛内固定, 以防止破损。 在拧紧底部夹具之前, 将拉拔臂延伸至其最大垂直位置。注意: 这一步是必不可少的。没有充分延长拉拔臂将导致不规则分离的两个部分的玻璃灯丝。 检查加热和牵引机构的设置。选择热 #1 与开关 (990) 和设置拉在 059 (图 2)。 使用开/关开关打开仪器。 关闭保护有机玻璃防护罩, 然后按拉拔器右下角的按钮。铜线圈将开始加热, 将焕发明亮的橙色。随着温度的升高, 玻璃纤维将开始拉伸并最终分离。玻璃丝两端分离后, 仪器会断电。注: 铜卷将保持极热几分钟。被拉扯的玻璃灯丝将被提到作为 ‘ microcapillary ‘ 从这点向前在协议。 小心避免接触铜线圈, 取出一个玻璃 microcapillaries。microcapillary 应该有一个非常好的点。用乳胶或腈手套小心处理 microcapillary, 立即进入包含微量装置的生物安全柜。注: 玻璃 microcapillary 非常锋利, 非常脆。小心处理。 松开微臂的端盖。将拉 microcapillary 的钝端插入微支架的开口端, 并将其向内推直到停止。 通过重新端盖将 microcapillary 的钝端固定到微臂上。注: 在微注射系统上安装 microcapillary 时, 要注意避免接触锐端。这将减少污染的机会, 并保留微注射的罚款点。未正确保护 microcapillary 会导致玻璃纤维在注射过程中不稳定或破损。 打开玻璃 microcapillary 的尖端。在被拉扯的玻璃 microcapillary 的准备期间, 点的尖端可能熔化用这样方式密封 microcapillary 的针对性的末端。要消除此堵塞: 定位微, 使 microcapillary 在解剖范围的玻璃阶段被指向, 而不触及这个表面。 找到一个无菌塑料表面 (文化板盖子的底部工作完美), 并把它放在显微镜阶段直接在 microcapillary 针的解剖范围的阶段。 将 microcapillary 的尖端放在观察区的中心, 并确保在1.5X 放大倍数下透过显微镜的目镜观察它是可见的。 使用微控制, 慢慢推进微臂和 microcapillary 向无菌塑料文化盖, 直到尖端几乎没有接触塑料表面和尖端的 microcapillary 打破自由。注: 瞄准最小的可能的断裂, 允许流体从玻璃纤维的流动, 以便最小化损伤对 HIO 在注射期间。 microcapillary 远离无菌表面, 以尽量减少意外破裂的机会, 然后再继续。 通过压低玻璃注射器, 通过油管推动矿物油, 检查 microcapillary 的流动。如果 microcapillary 的末端已经打开, 你会看到一小滴矿物油从 microcapillary 的尖端出现, 几秒钟后。如果不发生此情况, 请重复前面的步骤和重新。 3. 无菌显微注射 注: 一旦 microcapillary 已准备好, 安装, 并测试, 开始 microinjecting HIOs。图 3说明了已成功注射 FITC 葡聚糖的组织衍生 HIO。 用注射材料填充 microcapillary。将玻璃 microcapillary 的尖端浸入 FITC 葡聚糖注射液悬浮液中, 小心避免 microcapillary 的尖端与管子的两侧或底部断裂。一旦 microcapillary 的尖端被淹没在溶液中, 拉回矿物油注射器绘制约10µL 的 FITC 葡聚糖悬浮液进入 microcapillary。注: 建议使用1.5 毫升或0.5 毫升的注射解决方案/文化管, 因为这些将是最容易访问的安装 microcapillary。或者, 注射解决方案可以从无菌的培养皿或无菌膜, 这可能减少锐受伤的机会, 限制需要保持在接近 microcapillary 的管。如果悬浮液高度粘稠, 或者 microcapillary 的开口非常小, 则可能需要几秒钟的时间来填充 microcapillary。不要在塑料微注射管中抽取微注射悬浮液, 因为这可能会污染整个注射系统。 停止填充 microcapillary 当微注射悬浮填料填补了90% 的长度的玻璃 microcapillary。在从微注射溶液中取出 microcapillary 之前, 先压低注射器, 以确保 microcapillary 的尖端不含空气。注意: 如果检查的 microcapillary 显示的空气袋, 空和填写。 从细胞培养箱中取出 HIO 培养板, 并将其转移到微量的生物安全柜中。 从生物安全柜内的 HIO 培养基上取下盖子, 并将第一井放在显微镜台上, 以便在最低的放大倍数设置下通过示波器的目镜清晰地看到。 转动微臂, 使 microcapillary 在 HIO 的文化中有一个角度和 #62; 45 °相对于显微镜阶段。这是最容易完成的, 手动转动微臂组件在其水平轴, 在水平微臂支持满足垂直立场, 因为精细控制 (黑色表盘) 的范围有限运动.将 microcapillary 的尖端置于介质表面上方大约1厘米处 (图 3A) 之上。在图 3B中显示了一个具有代表性的图像, 演示了组织衍生的小肠上皮 organoids 的显微注射。 检查玻璃丝和 HIO 的尖端是否通过目镜可见。必要时重新定位。 通过顺时针旋转 Z 轴控制旋钮, 缓慢地推进 microcapillary。注: 判断 microcapillary 尖端的位置, 特别是深度, 需要练习。当刀尖破坏介质表面时, 请注意 microcapillary 尖端的轻微视觉失真。从这一点出发, 以避免打破 microcapillary 对底部的文化板块或破坏 HIOs。 用 microcapillary 尖刺穿 HIO。当 microcapillary 开始施加压力时, HIO 的外表面会略有降低, 当尖端穿透流明时, 它会重新回到形状。在 HIO 腔内识别 microcapillary 的尖端可能很难。如果看到 microcapillary 有困难, 请调整解剖范围的光照或放大设置。 当 microcapillary 正确定位于 HIO 中心附近的 microcapillary 的尖端时, 将手从微控件中移除。 稍微压低矿物油注射器, 将微注射液从 microcapillary 中推入 HIO 腔。HIO 可能略有扩大, 以适应注射量。注意: 小心避免 over-filling HIO, 因为这会导致化爆裂。作为一个经验法则, HIO 体积的任何可见扩展意味着它是停止的时候了。成熟 HIO 腔的平均容积约为1µL, 但可能相差很大。自动注射器泵可用于代替手动注射器, 以便对注射量进行精细控制。 使用 Z 轴控制和介质表面上方的位置将 microcapillary 从 HIO 中取出。 移动到下一个 HIO 目标与 microcapillary 位于媒体上方, 以避免意外损坏的 HIOs 在机动和注入类似的方式 (见步骤 3.6-3.11)。 使用上面介绍的方法重新填充 microcapillary。注: 如果针尖在注射过程中的任何一点断裂, 请勿尝试继续注射。根据下面的说明更改提示。 在治疗或破损的情况下改变 microcapillary。松开微臂末端的夹钳, 并将 microcapillary 从微支架上取下。注意: 不要在尖端附近处理 microcapillary。microcapillary 的细微点非常锋利, 很容易刺穿手套和皮肤。使用谨慎, 并注意所有的动作, 处理 microcapillary 使用的机械手, 从来没有放在 microcapillary 和 HIO 文化的点之间的手。在 microcapillary 含有传染性物质或毒素的针头上立即寻求医疗治疗。注: 在某些情况下, 它可能难以直观确认成功的 HIO 微注射。使用高浓度的 FITC 葡聚糖可提高透明微注射悬浮液的可见度。 4. HIOs 的药理治疗 要测试的化合物交付到顶端上皮, 重在无菌 PBS 含有2毫克/毫升 FITC-葡聚糖和 microinject 进入 HIO 腔如上所述 (第3节)。在代表性实验中, 重难辨梭菌毒素 TcdA 在 12.8 ng/µL 的 PBS 中含有 FITC 葡聚糖。 要测试送到侧室的化合物, 用含有2毫米乙二醇二 (β-氨基乙基醚)-n、n、n、n-乙酸酸 (EGTA) (正控制) 的新介质取代外部培养基, 仅 PBS 汽车 (负控制), 或其他实验性化合物后注射 FITC 葡聚糖。注: 药物化合物、毒素或其他制剂的应用剂量和时间可能会因实验问题而异。 5. 微量 Organoids 的现场成像 在注射后立即开始实时成像。将培养皿转移到具有37° c 和 21% O2和 5% CO2的带有自动活细胞成像系统的加湿腔室的荧光显微镜。关闭环境室并启动成像过程。 从桌面启动图像分析软件 (例如, softWoRx)。单击 “文件” 并选择 “获取 (解决 3D)” 以初始化成像和显微镜控制软件。 设置励磁/发射到 FITC (475 nm excitation/523 nm 发射), 设置传输功率为 5%, 镜头到4X。将曝光时间设置为0.025 毫秒 (图 4A)。注意: 曝光时间应变化以适应荧光信号的强度。一般而言, FITC 荧光信号只会减少。因此, 为了确保最大的灵敏度, 应调整初始曝光时间, 使记录的荧光信号刚好低于相机和成像软件的饱和点。 使用与显微镜相连的数字控制器, 在4X 放大倍数下找到 HIOs。将 HIO 居中显示在查看字段中 (图 4A)。 单击工具栏上的 “查看”, 然后选择 “点列表” 以显示新窗口。单击 “标记点” 以将舞台的当前位置存储在点列表中 (图 4A)。 重复步骤5.4 和 5.5, 直到记录所有 HIOs 的位置。使用记事本或数字记录, 记下分配给每个程序显微镜位置的唯一 ID 号以及在该位置捕获的图像。图像文件将用这个 ID 号标记, 在数据收集完成后, 将图像 id 号与特定的 HIOs 和处理相关联是很重要的。 要设置自动图像收集, 请单击工具栏中的 “文件” 和 “实验”。用日期或其他唯一名称命名实验。 通过遍历每个选项选项卡来设置图像集合的参数, 如图 4B所示。 联合国检查 “Z 切片” 下的标签 “切片”。 在 “通道” 选项卡下, 输入左上 “解析 3D” 窗口中的参数。若要节省时间, 第一行将在选中左侧的框时自动填充。 在 “时间推移” 选项卡下, 检查标记为 “时间推移” 的方框, 并输入标记为 “时间失效” 的行中图像与在标记为 “总时间” 的行中的实验总时间之间的时间间隔。软件将自动计算时间点的数量。 在 “点” 选项卡下, 选中标有 “访问点列表” 的方框。还可以通过在文本框中键入来手动输入要包含在实验中的特定点编号。 不要更改选项卡 “面板” 或 “操作” 下的默认选项。 单击 “运行” 选项卡. 在标记为 “图像文件名” 的框中输入实验日期, 并在 “设置” 下设置数据保存位置。 单击绿色箭头运行实验宏。一个时间推移计数器将跟踪实验进展。 在计划的时间课程结束时, 将所有图像文件导出并保存为24位 RGB TIFF 图像 (图 4C)。 在工具栏上, 选择 “任务生成器” 后面的 “进程”。 在 “任务生成器” 菜单中, 通过导航到5.9 中指定的数据文件夹来添加文件。通过在提示中键入 “*. dv” 来突出显示所有以 “.” 结尾的文件。选择全部 (Ctl + A), 然后单击 “添加”。 在标记为 “任务” 的部分下单击 +。选择 “导出为…” 并单击 “选项” 选项卡。 将 “导出格式” 设置为 “TIFF 图像”, 然后选中下面的框添加 “自定义输出文件夹”。这是将导出 TIFF 图像的位置。在 “TIFF 输出类型” 下选择24位 RGB, 然后单击 “完成”。 单击 “提交到队列” 以运行导出宏。 如果要在另一台计算机上执行后映像分析 (第6节), 请将5.11 中导出的 TIFF 图像复制到外部驱动程序或服务器上。注: HIO 组织和培养基可存储为组织学34、PCR35)、西部印迹36或其他下游分析。 6. 后成像分析 确保在要用于分析的计算机上安装了 ImageJ37并正常工作。注: 斐济37是 ImageJ 核心程序的一个替代分布, 将同样适用于此分析。 通过从 ImageJ 菜单中选择 “过程” 然后 “批处理”, 最后从 “宏” 开始进行批分析。 将输入设置为包含在实验时间过程中收集的 TIFF 图像的目录。打开 “thesholdmeasure ijm” ImageJ 宏文件, 或直接将宏代码复制/粘贴到窗口中。单击 “进程” 开始处理文件。注意: 最小阈值x (setThreshold (x, 255);) 可以设置为任意数字 0-255, 并应进行调整, 以消除背景荧光。建议使用值和 #60; 100。为了根据经验确定适当的阈值, 在一个表示无荧光信号的化的单个图像上运行成像宏。此图像的平均强度可以作为适当设置阈值的指南。对于下面介绍的代表性分析, 阈值设置为 “42”。 ImageJ 将生成一个大表, 其中包含阈值强度范围内的所有像素区域, 以及阈值强度极限范围内的平均值、中值、最小和最大 (极限) 强度值。将其保存为 CSV 或 XLS。 在电子表格39中, 可以通过操作数据表来执行下面的计算, 也可以使用适当的编程语言自动完成对时间强度的更改。本手稿提供了一个在 R 40中编写的示例分析脚本。注意: 对于每个 HIO, 相对荧光强度可以量化为. 消除时间41 (t1/2) 的 FITC-葡聚糖在 HIO 腔中计算如下: 首先, 从描述相对荧光强度 (t) 的曲线上计算 “曲线下的区域” (联合自卫队) 为: 然后, 将”清除” () 的速率与分布 (Vd) 的容量一起计算为在t = 0 上的规范化荧光 1: 接下来, 将 “消除速率常数” () 定义为: 最后, 将 “消除时间” (t1/2) 计算为: 减少的等式因而是: