概要

L リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応

Published: February 16, 2018
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概要

光学活性アミノ アルコール足場として使用するための汎用性の高い分子は有機合成、です。ジアステレオ選択的 C-H 酸化による対応する水酸基のアミノ酸のカルボン酸残基の胸の谷間に続いてジオキシゲナーゼによって触媒を組み合わせた酵素カスケード反応によってアミノ アルコールを合成 L-リジンから始まって、脱炭酸酵素。

Abstract

アミノ アルコールは、アプリケーションの広い範囲で汎用性の高い化合物です。例えば、彼らは有機合成においてキラルの足場として使用されています。従来の有機化学の合成よく立体化の結果の困難なコントロールとの退屈な多段合成プロセスが必要です。48 h ですぐに利用できる L リジンから酵素によってエレメンタリー アミノ アルコールにプロトコルを提案します。このプロトコルは、従来の有機合成による実施し非常ににくい 2 つの化学反応を組み合わせたものです。リシンの unactivated C-H 結合の最初のステップ位置、ジアステレオ選択的酸化の側鎖は; ジオキシゲナーゼによって触媒します。regiodivergent ジオキシゲナーゼによって触媒 2 番目 regio ・ ジアステレオ選択的酸化は、1, 2-ジオールの形成につながることができます。最後の手順で α アミノ酸のカルボキシルはリン酸ピリドキサール (PLP) の脱炭酸酵素 (DC) によって切断され。Decarboxylative ここだけベータ/ガンマ位置にヒドロキシ置換ジャスモン センターを維持、アミノ酸の α 炭素に影響します。結果として得られるアミノ アルコールは光学的濃縮されてしたがっています。プロトコルは、4 つのアミノ アルコールの semipreparative スケール合成に正常に適用されました。反応の監視によって実施されました高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による誘導体化後 1-フルオロ-2, 4-ジニトロ。固相抽出 (SPE) による簡単な浄化は、優れた収率とアミノ アルコールを与えられる (93% > 95%)。

Introduction

生体触媒によって提供される利点があるにもかかわらず合成経路や総生体触媒ルートの生体触媒のステップの統合ほとんど酵素の速度論的解像度に限られたまま。これらのルートは、不斉化学酵素合成の最初のステップとして広く使用されているが、生体触媒高立体選択性1,2,3 機能グループ相互変換でより多くの可能性を提供しています。.また、生体触媒反応は、同様の条件で行われているしたがって、ワンポット ファッション4,5で連鎖反応を実行する実行可能なは。

光学活性アミノ アルコール助剤または有機合成6の足場として使用する汎用性の高い分子である.二次代謝産物と原薬 (API)、アミノ アルコール部分は多い。主な β-アミノ アルコール類、γ-アミノ アルコール類のキラルにへのアクセスが従来の化学合成によって対応する α-アミノ酸の酸からすぐに利用できるまたは二次アミノ アルコールはしばしば一緒に敏感な退屈な合成経路を必要と立体化学7,8,9,10のコントロール。その高い立体選択性により生体触媒これらキラル11,12,13,14に優れた合成経路があります。

我々 は、ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンを報告した/α-ケト酸依存性オキシゲナーゼ家族 (αKAO) (図 1)15。KDO1 ジオキシゲナーゼ L リジンから始まって、(3S) – 水酸基誘導体 (1)、(4R) – の形成を触媒する特に、デリバティブ (2)、KDO2 ジオキシゲナーゼとの反応によって形成されます。KDO1 と KDO2 によって連続 regiodivergent アントシアンが – ジヒドロキシ – L (3R, 4R) の形成につながる-リジン (3) 光学的に純粋な形で。ただし、これらの酵素の基板の限られた範囲は、アミノ基の α 位のカルボン酸残基が活動16に不可欠な化学合成、特に単純なアミンの水酸化の大規模な利用を妨げます。

Figure 1
図 1: L-リジンの生体触媒変換します。(3S) への変換 – ヒドロキシ – L-リジン (1) 触媒による KDO1 ジオキシゲナーゼ;(4R) – ヒドロキシ – L-リジン (2) 触媒による KDO2 ジオキシゲナーゼ;(3R, 4R) – ジヒドロキシ – L-リジン (3) KDO1 と KDO2 dioxygenases による連続触媒カスケード反応によって。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

脱炭酸代謝17一般的な反応であります。特に、アミノ酸 Dc (EC 4.1.1) 因子無料 (pyruvoyl に依存) または PLP 依存した酵素と細菌と高い生物18,19対応するポリアミンにアミノ酸の脱炭酸を触媒します。,20,21,22. 水酸化カダベリン、L リジンの脱炭酸によって得られるジアミンに、モノとジヒドロキシ化合物 (図 3) 47, 1011対応します。カダベリンは化学工業の主要なビルディング ブロック、特にそれはポリアミド、ポリウレタン高分子のコンポーネントです。したがって、再生可能な資源からこのジアミンのバイオ生産は、石油ベースのルートの代替として注目を集めているし、様々 な微生物は、この目的のために設計されています。これらの代謝経路でリジン DC (LDC) はキー酵素であります。LDC は、アラニン ラセマーゼ (AR) 構造家族23に属する PLP 依存した酵素であります。PLP 依存性 DCs (PLP Dc) は、高い基質特異的知られています。ただし、いくつかの酵素自身の子牛 rumirantium (LDC下さい Srum) から LDC の例として、L-オルニチン、L-リジンのアミノ酸の方活躍中のわずかな混乱の機能のと同様の速度定数があります。リジン、オルニチン脱炭酸24,25。この拡張の基質特異性は、この酵素のモノラル- とディ-ヒドロキシ-L-リジン脱炭酸に適して。また、リジンのヒドロキシ誘導体に向かってアクティブな Dc の発見を αKAO 酵素をコードする遺伝子のゲノムのコンテキストを検討しました。確かに、原核生物ゲノムの同じ生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子が一般的に共同でローカライズされて遺伝子クラスター。推定 PLP DC (図 2) をコードする遺伝子と共局在 ( Chitinophaga pinensis) から KDO2 遺伝子が見つかりました。これに対し、DC の遺伝子が見つかりませんでした KDO1 ジオキシゲナーゼのゲノムのコンテキストを解析するとき。PLP DC 蛋白質c. pinensis (DCCpin) からしたがって、カスケード反応の脱炭酸のステップを触媒する有望な候補として選ばれました。

Figure 2
図 2: C. pinensisにおける KDO2 遺伝子のゲノム コンテキストこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

したがって、我々 は dioxygenases とアミノ酸 (図 3) から脂肪族光学活性 β- および γ-アミノ アルコールの合成を達成するために Dc を含む酵素カスケード反応を設計されています。既報の通り、αKAO によって触媒 C H 酸化紹介合計ジアステレオ; ヒドロキシ置換ジャスモン センターCβ/γ カイラリティは、アミノ酸を有する16の先端カーボンにのみ影響 decarboxylative の手順で保持されます。

Figure 3
図 3: Retrosynthetic 解析します。(A) Retrosynthesis β と γ-アミノ アルコール (R) – 1, 5 – diaminopentan-2-オールの (4) (5R) – ヒドロキシ – L-リジンと (S) – 1, 5 – diaminopentan-2-ol (5) と 1, 5-diaminopentan-3-オール (6) からL-リジン。(B) Retrosynthesis の β、γ、β、δ-アミノ酸ジオール (2S, 3S) – 1, 5 – diaminopentane-2, 3-ジオール (10) (2R4S) – 1, 5 – diaminopentane-2, 4-ジオール (11) (5R) から始まって-ヒドロキシ-L-リジンと (2R, 3R) – 1, 5 – diaminopentane-2, 3-ジオール (7) L リジンから始まって。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

L-リジンとその (5R) から始まって-ヒドロキシ誘導体報告 2/3 ステップ、1 つの鍋、dioxygenases とアミノ アルコールをターゲットに取得する PLP Dc 結合酵素のプロシージャ。前に合成反応条件、例えば、開始材料の完全な転換に必要な酵素の濃度を調整する分析スケールで開発されたメソッド標的分子の実験室規模でこの手順も紹介します。

Protocol

1. 酵素製剤 表現し、上記26として蛋白質を浄化します。注: 次の最終濃度で組換えタンパク質が得られた: Catenulispora acidiphila、UniProtKB ID から αKAO: C7QJ42 (KDO1)、1.35 mg/mL;C. pinensis、UniProtKB ID から αKAO: C7PLM6 (KDO2)、2.29 mg/mL;S. rumirantium、UniProtKB ID から PLP Dc: O50657 (LDC下さい Srum) 12.44 mg/mL で合計酵素と無細胞抽出C. pinensis、UniProtKB ID から…

Representative Results

ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンについて報告した/16αKAO 家族 (図 1)。両方の要件を満たすために調節された反作用の状態触媒による触媒 PLP DC による脱炭酸ステップが続く、αKAO 1 つまたは 2 つの水酸化反応ステップを組み合わせると、今回紹介した全体のカス…

Discussion

光学活性アミノ アルコールおよび派生物薬物療法が有機合成光学活性助剤から、アプリケーションの広い範囲があります。従来の有機合成によるアミノ アルコールを生産するための多段階の合成は多数あるが、できない場合があります常に効率的な立体化学16の敏感な制御手順と退屈な保護・脱保護のため。保護・脱保護手順と分配するため、通常の高立体選択的生体触媒…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、テクニカル サポートのペギー Sirvain クリスティン Pellé とアラン ・ ペレ ヴェロニク Berardinis 有意義な議論のためにありがとうございます。

Materials

HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

参考文献

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記事を引用
Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

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