研究多, 内源性修饰修改的目标蛋白可能是极具挑战性的。这里描述的技术利用一个优化的裂解缓冲和过滤系统开发了特定的 PTM 靶向, 亲和矩阵, 以检测乙酰化, 泛, sumo 2/3 和酪氨酸磷酸酯的修改为目标蛋白质使用单一的, 流线型的系统。
现在欢迎的是, 修饰修饰 (PTMs) 在调节蛋白质的结构和功能方面起着不可或缺的作用, 这对于特定蛋白质的生理和病理作用是必不可少的。在研究目标蛋白的 PTM 状态时, PTMs 的富集常常是必要的, 因为 PTMs 往往是短暂的, 而且丰度相对较低。当对目标蛋白的 PTM, 如缓冲不相容, 靶蛋白抗体不兼容, 丢失 PTM 信号等, 会遇到很多陷阱。在研究多种 PTMs 如乙酰化、泛、sumo 2/3 和酪氨酸磷酸化为特定靶蛋白时, 难度会放大。研究这些 PTMs 的组合可能是必要的, 因为 PTMs 之间的串扰是普遍和关键的蛋白质调节。通常, 这些 PTMs 在不同的裂解缓冲剂和独特的抑制剂组合物中进行研究。为了简化这一过程, 开发了一种独特的变性裂解系统, 有效地分离和保存这四 PTMs;因此, 在单个裂解系统中启用潜在串扰的调查。一个独特的过滤系统的设计, 以消除污染的基因组 DNA 的裂解, 这是一个问题 by-product 的变性缓冲区。针对四 PTMs 中每一个的鲁棒亲和矩阵与缓冲系统协同发展, 以最大限度地丰富和检测这四 PTMs 的内生状态。这一全面的 PTM 检测工具集简化了获取关键信息的过程, 即蛋白质是否由其中一个或多个 PTMs 修改。
翻译后的修改 (PTMs) 是对蛋白质的高度调控的改变, 藉以特定的方式增加或去除修改。PTMs 通常是动态的, 瞬变的变化, 极大地改变了蛋白质的结构, 与伙伴蛋白质的相互作用, 和空间定位, 并最终使蛋白质执行不同的功能1,2,3,4. PTMs 是如此丰富, 他们增加了独特的蛋白质形式 (或 proteoforms) 从大约3万基因产品的数量, 以超过 100万 proteoforms5,6。识别 PTMs 并定义其对靶蛋白的影响对于了解蛋白质的生理和病理功能是至关重要的7,8,9,10, 11、12、13、14。蛋白、p53 和表皮生长因子受体 (EGFR) 等选择蛋白的工作已经阐明了 PTMs15、16、17的调节作用。这些研究揭示了这样一个事实, 即这些蛋白质的调节发生在多个 PTMs, 在许多情况下, 这些修改的工作, 以促进一个特定的功能。新的研究表明, 合作和负 PTM 串扰可以发生在几个不同的蛋白质18,19,20,2122, 23,24,25。然而, 大多数蛋白质的 PTM 剖面是建立在几个研究, 使用了不同的模型和独特的条件。有一个优化系统, 以调查多个 PTMs 在一个系统将是非常有益的洞察潜在的 PTM 串扰的目标蛋白。
一个挑战与调查 PTMs 在一个单一的系统是, 特定的 PTMs 被调查使用不同的裂解缓冲。例如, 通常用于磷酸化或泛调查的缓冲 (如帕或 NP-40) 的使用可能不足以研究不稳定的 PTM, 如小泛素样修饰剂 (相扑) ylation26。此外, 变性缓冲区不足以游离蛋白质的相互作用, 并可能导致假阳性 PTM 识别27。调查 PTMs 的变性裂解缓冲可能是首选的, 因为它是明显更好地隔离蛋白质从所有细胞室28, 将离解大多数蛋白质的相互作用, 并将抑制蛋白酶, 改变 PTM 状态, 如deSUMOylases 26;然而, 变性缓冲器可能损害特定亲和试剂 (如泛素结合基于域的工具27) 的完整性。开发一种类似变性的裂解系统来研究亲和试剂相容系统中蛋白质的多重 PTMs, 对于 PTM 串扰的调查是非常有益的。
虽然变性缓冲器的主要优势超过变性缓冲区的调查 PTMs, 他们很少使用, 因为它们的重大缺陷, 如与传统的蛋白质检测不相容, 重要的基因组脱氧核糖核酸 (脱氧核糖核酸) 污秽和中断对沉淀 (IP) 试剂29。这些缺点可能导致延长准备时间和潜在的损害目标蛋白时, 剪切基因组 DNA。用于剪切 DNA 的两种常用方法包括注射器裂解和超声29。这两种方法都需要广泛的优化, 而且往往缺乏精确的重现性。除去基因组 DNA 的替代方法包括增加 DNAses;但是, 这可能需要额外的优化和缓冲区组成的变化。最终, 一个简单和可重现的方法, 以消除基因组 DNA 污染将有利于在使用变性裂解缓冲剂的 PTM 调查。
这项技术的目的是建立一个系统, 孤立和调查泛 (布法罗), 酪氨酸磷酸化, sumo 2/3 (相扑 2/3), 和乙酰 (Ac) PTMs 在一个单一的系统, 以更好地研究 PTM 串扰的目标蛋白。利用该 PTM 检测系统, 对单个系统中几种靶蛋白的内源 PTM 剖面进行了快速研究。对潜在的串扰的新洞察被辨认了30,31。总的来说, 这里描述的技术改进了现有的方法来调查 PTMs 和 PTM 串扰在三种不同的方式: 1) 一个独特的变性缓冲被开发, 分离蛋白质从所有细胞室, 同时仍然是兼容PTM 亲和试剂, 2) 一个独特的过滤系统的发展, 迅速消除基因组 DNA 污染的变性裂解具有高重现性, 不需要专门的设备, 和 3) 强大的亲和珠, 裂解系统, 抑制试剂是相容的;因此, 简化了这四 PTMs 的分离, 为目标蛋白最大化 PTM 富集, 并有效地检查潜在的串扰。
用于确定目标蛋白是否由 PTM 修饰的初始方法可以使用目标蛋白特定的 ip 抗体进行, 其次是 PTM 抗体 (e. g, anti-acetyl 赖氨酸), 或使用 PTM 抗体为 ip,其次是免疫印迹与靶蛋白特异抗体30,31,33。虽然这两种方法的理论工作, 利用目标蛋白特异抗体有更多的潜在缺陷, 如抗体可能不是 IP 兼容, 或大 PTM 修改可能阻断抗体识别网站上的目标蛋白34 ,35。PTM 亲和珠的优点是抗体或结合域特别承认 PTM 的兴趣;因此, 对目标蛋白的修饰不应改变亲和珠的识别。以此为例, 用这里描述的技术进行了 PD-L1, 并观察到了内源性单和多聚物 (图 4)。Lim et al最近发布的一篇文章。利用体外技术来调查 PD-L1, 结果与图 436中显示的结果非常相似。有趣的是, 他们还执行了 PD-L1 抗体的 IP, 以丰富 PD-L1 从细胞裂解, 在那里表达和 MG-132 增加, 以提高信号。该模式是不健全的, 非常不同于体外的模式。细胞培养模型中内源性 PD-L1 的研究没有在 Lim et al中进行。报告以阐明其细胞培养与体外数据之间的差异。
调查一个蛋白质是否被 PTM 修改可能是挑战, 由于它的丰盈和瞬态的自然37,38, 并且经常需要通过 IP 丰富。PTMs 的有效 IP 需要优化几个关键步骤和试剂, 如裂解缓冲剂和亲和试剂。当调查目标蛋白的多个 PTMs 时, 所需的优化可能会增加。利用 blastR 裂解系统是该协议的关键一步, 因为它保持了强健的 IP 能力, 同时在一个系统中能够对 PTM、相扑2/3、布法罗和 Ac PTMs 进行检测。此技术优化了确定特定目标蛋白是否由这四 PTMs 进行修改所需的时间和资源, 并可能提供更好的 PTM 串扰的图片, 相对于使用多个裂解系统进行的 PTM 结果比较。对 blastR 裂解体系与替代 PTMs (如糖基化) 的相容性进行了研究;然而, 对所有类型的 PTMs 都没有进行过详尽的检查。
丰富的基因组 DNA 可以通过色度或 nanodrop 的方法干扰蛋白质的测量, 影响 SDS 丙烯酰胺凝胶中蛋白质的迁移, 并在 IP 分析过程中防止蛋白质和亲和基质相互作用。这里描述的方法利用一个专门的过滤器有效地去除基因组 DNA 污染, 这是该协议的另一个关键步骤。为了突出这一点, 在 blastR 过滤器处理前后进行了粘度测试, 结果显示, 从高粘度到水的粘度降低 (数据没有显示)。在图 3中的结果支持了这种粘度的变化, 显示几乎所有的基因组 DNA 都被移除。重要的是, dna 不是用这种方法剪切的, 因为任何剪切的 dna 都不会被过滤器捕获 (数据没有显示)。这个工具优于传统的方法, 如超声或注射器-dna 剪切, 因为它不需要专门的设备, 是高度重现性, 并删除 dna, 而不是剪切它。此外, 它不会降低在裂解液中的蛋白质, 这可能会发生使用传统的方法29。与其他方法相比, 使用过滤器需要 5-30 秒的时间, 而 dna 的有效击穿可能需要几分钟 (即, 注射器剪切), 并且可能导致样品的异质性, 因为 dna 污染物残留在裂解物中。对裂解物和 post-blastr 的筛选进行了广泛的分析, 马斯亮、靶向性的西方、总的和靶向特异的 PTM 分析均未观察到蛋白质剖面的显著差异;因此, 筛选出的基因组 DNA 可能不会影响蛋白质的完整性。最终, 这个过滤系统是有益的任何西方或 IP 应用的基因组 DNA 存在, 并可能影响解释的蛋白质分析。
重要的是要注意, 有潜在的假阴性检测利用这种技术, 这可能是由于亲和力珠饱和度, 结合现场干扰, 或 PTM 掩蔽。例如, 某一特定靶蛋白可以通过 Ac 在极低的水平上进行修改;因此, 它可能不会被孤立的泛乙酰赖氨酸亲和珠已饱和的更丰富的交流修饰目标蛋白。目前正在进行研究, 以评估该协议中所使用的亲和试剂的检测限度, 但最近的一份出版物表明了非常可靠的检测限制。数据显示, 这项技术可以确定每单元的17乙酰目标蛋白分子的31。尽管如此, 特定的情况, 如细胞类型特异性, 瞬态 PTMs 响应特定的刺激, 或掩蔽 PTMs 由于蛋白质相互作用可能导致假阴性结果。这些是这种技术的潜在缺陷, 以及大多数 PTM 的 IP 方法。因此, 建议使用多种方法来确认结果。
如糖基化和磷酸化的修改已经显示出竞争类似的氨基酸39,40, 和其他 PTMs 像泛和磷酸酯已被证明工作顺序, 以调节蛋白质的函数17,41。最近关于病理蛋白 tau 的研究突出了 PTM 串扰的重要性, 其中 tau 超磷酸化和 tau sumo 增强了彼此的42。此外, 该组显示, sumo 的头防止了多聚和随后的 tau 退化, 可能导致聚集。这只是许多管理 PTM 串扰的例子之一, 这项技术的效用将有助于阐明 PTMs 及其串扰在调节健康和疾病关键蛋白中的重要性。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢细胞骨架 Inc. 研究科学家和 Drs. 布莱恩. 胡佛和阿什利. 戴维斯对手稿进行评论、编辑和富有成效的讨论。此外, 我们感谢 Dr. 在制作视频手稿时所作的贡献。这项工作得到了资助, 从骨架 Inc。
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
cell scrapers | Costar | 3008 | |
BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
PTM Immunoprecipitation | |||
Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
Cell growth and treatment | |||
Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |