Сочетая анализов количественных пищи и насильно активации нейронов для изучения аппетит у дрозофилы

Количественная оценка количество пищи, организм имеет важное значение для оценки нескольких аспектов кормления контроля мозга в ответ на внутренние потребности (например, голод государств) и внешних факторов (например, качество пищи и вкусовых качеств)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. в последние годы, усилия по расшифровке нейронных субстратов кормления контроля у дрозофилы привести к развитию несколько анализов напрямую подсчитать количество пищи, организм или служить индикатором питания мотивации ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

Капиллярные фидер (CAFE) пробирного^12,13 был разработан для измерения объема потребления жидких пищевых продуктов в микрокапиллярной стекла. КАФЕ является весьма чувствительным и воспроизводимые¹⁷ и упрощает измерения потребления продуктов питания, особенно для количественной оценки долгосрочного питания¹⁸. Однако этот assay требует мух подняться на кончик микрокапиллярной и кормить вверх вниз, который подходит не для всех штаммов. Кроме того потому что мух проверяется с помощью кафе assay должны воспитываться на жидких пищевых продуктов, воздействие этих воспитания условия на метаболизм статус или потенциального недоедания остается быть обусловленным.

Хоботок расширение ответ (PER) пробирного^11,14 подсчитывает частоту Хоботок расширение ответы к нежные прикосновения капель пищи. В Пробирной зарекомендовал себя как отличный способ оценить кормления мотивации отдельных полетов и ослов влияние вкусовых качеств и содержание питания^18,19. Однако это не прямой количественной оценки объема потребления.

Недавно полуавтоматический метод, ручной подачей пробы (СДЕЛАВ)¹⁵, была разработана. В СДЕЛАВ один иммобилизованных Муха вручную подается с микрокапиллярной, содержащих продуктов питания. Учитывая, что Хоботок расширение ответы и потребление продовольствия могут контролироваться одновременно, СДЕЛАВ подходит для оценки питательной ценности и последствия манипуляции фармакологическом. Однако иммобилизирующие Муха может отрицательно сказаться поведенческих производительности, включая питание.

Кроме того, летать Хоботок и деятельность детектор (FlyPAD)¹⁰ был разработан, чтобы автоматически подсчитать кормления поведение. Используя методы видения машины, FlyPAD записи физических взаимодействий между летать и продовольствия для количественного определения частоты и продолжительности Хоботок расширений в качестве показателя кормления мотивации. FlyPAD обеспечивает что высок объём подход для мониторинга питания поведения-перемещение летать, хотя чувствительность и надежность этой системы остается далее подтверждается более исследования¹².

Обозначая стратегии часто используются для оценки употребления пищи в мух. Она является общей для обозначения продуктов питания с химических индикаторов и, после кормления, измерить количество попадает трассировщик для вычисления количества потребляемой пищи. Радиоактивные Трейсеры^{16,17,20,21,,2223,24,25} позволяют для обнаружения через кутикулу без гомогенизации мух. Этот метод обеспечивает удивительно низкой изменчивости и высокая чувствительность¹⁸и возможно для долгосрочного исследования потребления пищи. Однако наличие использования радиоизотопов и различных темпов поглощения и выведения должны приниматься во внимание при работе с этот assay.

Маркировки и отслеживания пищи с нетоксичные красители это безопаснее и проще альтернатива^2,3,26,27,28. Мухи гомогенизированных после кормления с пищей, содержащих красители растворяется и не рассасывающиеся, и количество попадает красителя позднее количественно с помощью спектрофотометра^3,24,28,29 . Обозначая стратегия легко выполнить и обеспечивает высокую эффективность, но с оговоркой. Объем потребления пищи, по оценкам от краска попадает меньше, чем фактический объем, поскольку выведение начинается 15 мин в кратчайшие сроки после того, как мухи начать кормить¹⁷. Кроме того анализ оценивает проглатывание пищи обычно в течение 60-мин, который подходит только для расследования краткосрочных кормления поведение^24,28. Кроме того несколько внутренних и внешних факторов, таких как генотип¹⁷, пол¹⁷, вязка государства¹⁷, воспитание плотность³⁰, суточный ритм^31,32и качества продовольствия^{3 , 8 , 16}, влияние пищи. Таким образом продолжительность кормления может потребоваться корректироваться с учетом конкретных экспериментальных условиях. Помимо облегчения количественной оценки потребления пищи, пищевые красители используются также для оценки продовольственной Выбор^2,19,27и визуализировать мениска в микрокапиллярной в кафе пробирного¹².

Здесь мы представляем протокол комбинированные манипуляции нейронной активности с подходом, краситель маркировки. Эта стратегия была оказался полезным в нашей neurogenetic исследование кормления контроля взрослых плодовых мушек²⁴. Метод визуального скоринг позволяет для быстрой оценки потребления продовольствия; Таким образом это полезно для проверки через большое количество штаммов своевременно. Кандидаты от экрана затем анализируются подробно колориметрическим методом предоставление объективной и точной количественной оценки дополнительного исследования.

Помимо питания анализов мы также описать thermogenetic^27,33,34,35 и optogenetic³⁶ методы насильственно активации нейронов целевой у дрозофилы. Чтобы активировать нейроны, thermogenetic операция является простым и удобным с дрозофилы переходных рецептор потенциальных Анкирины 1 (dTRPA1), который является воротами температуры и напряжения катиона канал, который увеличивает возбудимость нейронов когда окружающего Температура поднимается выше 23 ° C^33,37; Однако тестирование животных при высоких температурах может произвести неблагоприятное воздействие на поведение. Еще один эффективный подход для активации нейронов в дрозофилы используется Оптогенетика с CsChrimson³⁶, который является разновидностью смещается красный channelrhodopsin, которая увеличивает возбудимость нейронов при воздействии света. Оптогенетика предлагает выше временное разрешение и меньшей нарушения поведения, чем thermogenetics. Сочетая количественное измерение потребляемой пищи с манипуляции нейронной активности представляет эффективный подход для изучения нейронных механизмов кормления.

Мы подробно описать подготовка питание камеры и мух для проверки. С помощью Taotie-Gal4 летит как модель²⁴, мы описываем активирующих нейронов, thermogenetics и Оптогенетика. Два анализов количественной оценки потребления продуктов питания с пищевой краситель меченых также описаны в протоколе.