الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة
概要
نقدم هنا، بروتوكول التي يمكن استخدامها لتصور مجهريا وتحديد حجم النشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة والحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار.
Abstract
تغيير الأيض الخلوية سمة مميزة للكثير من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والإصابة. الوحدات الحركية الأيضية للخلايا الإنزيمات وينظم نشاطهم بشكل كبير على العديد من المستويات، بما في ذلك النسخي، الاستقرار مرناً، ومستوى متعدية الجنسيات وبوستترانسلاشونال والوظيفية. يعني هذا النظام المعقد أن فحوصات الكمية أو التصوير التقليدي، مثل كمية مرناً التجارب و “اسطوانات يقوم الغربية” وإيمونوهيستوتشيميستري، تسفر عن معلومات غير مكتملة فيما يتعلق بهذا النشاط في نهاية المطاف من الإنزيمات، وظيفتها و/أو تعريب سوبسيلولار بهم. كمية الإنزيم سيتوتشيميستري وهيستوتشيميستري (أي، تعيين الأيضية) إظهار معلومات متعمقة في النشاط الأنزيمي في الموقع وحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار في حالة شبه الحقيقي للطبيعة.
يصف لنا وضع بروتوكول للكشف عن نشاط ديهيدروجيناسيس، وهي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال للحد من العوامل المساعدة مثل NAD(P)+ وبدعة. أقسام الأنسجة والخلايا هي المحتضنة في متوسط التي محددة للنشاط الأنزيمي من نازعة واحد. في وقت لاحق، ينفذ نازعة الذي يخضع للتحقيق النشاط الأنزيمي في موقعها سوبسيلولار. في تفاعل كيميائي مع المتوسط رد فعل، ينشئ هذا في نهاية المطاف formazan زرقاء اللون في موقع النشاط نازعة. ولذلك امتصاص فورمازان مقياسا مباشرا للنشاط نازعة ويمكن قياسها كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات.
بالإضافة إلى دراسات قائمة على الملاحظة، يمكن استخدام هذا الأسلوب للدراسات تثبيط إنزيمات معينة. وفي هذا السياق، دراسات تستفيد من مزايا حقيقية لطبيعة التعيين الأيضية، قد يكون إعطاء النتائج في الموقع أن فسيولوجيا ذات الصلة أكثر مما في المختبر الدراسات تثبيط إنزيم. في كل شيء، تعيين الأيضية أسلوباً لا غنى عنه لدراسة التمثيل الغذائي على المستوى الخلوي أو الأنسجة. من السهل أن تعتمد التقنية ويوفر معلومات متعمقة وشاملة ومتكاملة الأيضية ويتيح التحليل الكمي السريع.
Introduction
ركنا أساسيا في الفيزيولوجيا الخلوية هو التمثيل الغذائي. الأيض يوفر الخلايا بالطاقة اللازمة لجميع العمليات الفسيولوجية ويسلم اللبنات الأساسية للتركيب الحيوي الجزيئات، وينظم التوازن الخلوية فيما يتعلق بمنتجات النفايات وجزيئات سامة والتفكيك و إعادة تدوير مكونات الخلوية معطلة أو غير الضرورية. تحفيز ما يقرب من جميع التفاعلات الكيميائية الخلوية الحيوية الإنزيمات وبالتالي هي الوحدات الحركية في فسيولوجيا الخلايا. 1 , 2
أحكام تنظم نشاط الإنزيمات على مستويات عديدة وذلك كمية الإنزيم هيستوتشيميستري وسيتوتشيميستري (وتسمى أيضا تعيين الأيضية) هو الأسلوب المفضل لدراسة نشاط إنزيم في الموقع. أما على المستوى النسخي، هو تنظيم التعبير الجيني في مرناً. ويمكن تحديد أثر تنظيم النسخ استخدام الكمية فحوصات مرناً، مثل [ميكروارس] أو تسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة، أو فحوصات مرناً النوعية، مثل التهجين في الموقع الذي يعطي معلومات عن الخلوية (الفرعية) ترجمة جزيئات مرناً. وهذا يجعل من الممكن أن نقدر الفروق النسبية في النشاط الترانسكربتي بين الخلايا. ومع ذلك، معقد التفسير وصحة هذه فحوصات مرناً فيما يتعلق بالنشاط الأيضي للتنظيم يحدث أيضا على مستوى مرناً، حيث تسلسل واستقرار الجزيئات مرناً يتم تحريرها بعد ذلك يتم نسخها من الحمض النووي. وينظم هذا التحرير ترجمة isoform البروتين وكمية البروتين الترجمة في ريبوسوم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في عملية ترجمة البروتين ويؤثر في نهاية المطاف على التعبير الإنزيم وبالتالي النشاط. يمكن تقدير الآثار المجتمعة للخطوات التنظيمية المشار إليها أعلاه باستخدام فحوصات التعبير كمية البروتين، مثل “النشاف الغربية” أو المرحلة عكس البروتين ليستي [ميكروارس]، أو فحوصات التعبير البروتين النوعي، مثل إيمونوسيتوتشيميستري وإيمونوهيستوتشيميستري، ولكن هذه التقنيات تعجز عن إدماج الآثار التنظيمية المصب مثل تعديل بوستترانسلاشونال للبروتينات واللائحة الوظيفية للإنزيمات في المكروية مزدحمة بهم. وعلاوة على ذلك، التعبير عن إنزيم قد سيئة ترتبط بنشاطها، حتى أن قياسات النشاط إنزيم المنقي في هوموجيناتيس الخلايا أو الأنسجة أو حلول مخففة تستخدم على نطاق واسع للدراسات نشاط الإنزيم. ومع ذلك، تفشل هذه التجارب لتكرار تأثير السيتوبلازم مجزأة مزدحمة أو عضية على نشاط إنزيم. وعلاوة على ذلك، تحديد الكمية أو إضفاء الطابع المحلي على التعبير مرناً أو إنزيم جميع التقنيات المذكورة أعلاه، ولكن غير قادر على إعطاء معلومات شاملة عن كل جوانب هذه التعبير الإنزيم، ناهيك عن إدماج هذا المعلومات مع قرارات نشاط الإنزيم. 2 , 3 , 4
تعيين الأيضية يسمح التقدير لكل من المتغيرات المذكورة آنفا التي تحدد نشاط إنزيم. ما هو أكثر من ذلك، هو تعيين الأيضية شكلاً من أشكال الخلايا الحية أو تصوير الأنسجة مع الخلايا والأنسجة التي يتم الاحتفاظ بها سليمة أثناء تحليل لتوليد حالة تقريبا صحيح لطبيعة لتوليد بيانات نشاط الإنزيمات. وتنتج الصور التي تسهل كل تقدير مفصل موقع نشاط إنزيم، فضلا عن قوي التحديد الكمي لنشاط إنزيم داخل حجرة الخلايا أو الأنسجة. 3 , 4 البروتوكولات المبينة هنا لرسم خرائط الأيضية لنشاط dehydrogenases تستند على دليل المختبرات كافة أساليب histochemical الإنزيم المتاحة،5 في مبادئ كمية الإنزيم هيستوتشيميستري،6 وفي تحليل الصور من الخرائط الكمية الأيضية. 4
ديهيدروجيناسيس هي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال لتقليل العوامل المساعدة المتعارف عليه مثل NAD+، NADP+ وبدعة إلى NADH ونادف والقوات المسلحة الهايتية2، على التوالي. هي المحتضنة خلايا سليمة أو أقسام الأنسجة كريوستات التي هي غير ثابتة كيميائيا في متوسط رد فعل الذي يتضمن، بين الكواشف الأخرى، والركيزة، والعوامل المساعدة من نازعة محددة وملح تيترازوليوم. وفي وقت لاحق، أن نازعة ينفذ نشاط الحفاز ويقلل من NADP+ إلى نادف، على سبيل المثال،. عبر ناقلة إلكترون، تخفيض 2 نادف الجزيئات في نهاية المطاف 1 جزيء الملح tetrazolium شبه عديم اللون للذوبان في الماء في جزيء 1 formazan الأزرق تستعصي على الحل المياه رواسب فورا في موقع نازعة. ولذلك، امتصاص formazan سرع مقياسا مباشرا للنشاط المحلي لنازعة ويمكن ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري الخفيفة أو كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا التحديد الكمي البت في الموقع معلمات إنزيم الحركية، مثل نشاط إنزيم القصوى (Vmax) وتقارب من الركازة لأنزيم (كم). 3 , 4 , 5 , 6
عند التخطيط لتجربة تعيين ايضية، من المهم أن ندرك أن كل تجربة، ويوصي بحد أقصى خمسين الشرائح الزجاجية مع المنضمة خلية الأعمال التحضيرية أو أقسام الأنسجة لتقليل التأخيرات الزمنية أثناء الحضانة من أجل الحصول على متسقة النتائج. فمن الممكن عملية أكثر الشرائح و/أو التراكيب المتوسطة عندما تنفذ هذه الخطوات بروتوكول تعاوني بالمجرب أكثر. وعلاوة على ذلك، يوجد بعض التغير بين التجارب. ولذلك، يجب تكرار تجارب مماثلة على الأقل 3 مرات مع سيتوسبينس من كل إعداد الخلية أو مقاطع من كل عينة الأنسجة وضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في كل تجربة. دائماً إعداد وسيلة احتضان تحكم في غياب الركيزة ولكن وجود العوامل المساعدة على مراقبة لتلطيخ نشاط إنزيم غير محددة. النتائج الأكثر تمثيلاً يتم الحصول عليها في تجارب فيه تركيزات مختلفة الركازة/مساعد يتم تطبيقها على أقسام الأنسجة أو الخلايا الاستعدادات من نفس العينة، حيث أن المجرب يمكن إجراء تحليلات لأنزيم حركية استخدام منحنيات جرعة النشاط.
Protocol
Representative Results
Discussion
البحوث المتعلقة بالأيض الخلوية تشهد حاليا نهضة للباحثين يدركون الآن أن الآثار الأيضية من أهمية حاسمة في نشوء المرض وعلاج الكثير من الأمراض. وبمساعدة من 1 أبحاث الأيض وعلاوة على ذلك، قبل زيادة توافر التقنيات التي توفر هذا الحقل من البحث مع أدوات أكثر من أي وقت مضى، بما في ذلك الطيف الكتلي والعلامات راديويسوتوبيك والقياس الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. لا حال من الأحوال تعيين الأيضية تقنية رواية، ولكن قدرتها على إعطاء معلومات متكاملة عن النشاط الإنزيمات في حالة تقريبا صحيح لطبيعة يجعل هذا الأسلوب أكثر أهمية من أي وقت مضى. 2
وتوجد في جميع الخلايا الحية، مما يشير إلى أن dehydrogenases نشأ في وقت مبكر جداً خلال تطور العوامل المساعدة+ NAD و NADP+ ولها أدوار رئيسية في الأيض الخلوي. 14 , حاليا، هناك 15 523 ردود فعل تحفيز الإنزيم التي تصنف على أنها ديهيدروجيناسيس وتحدث عبر جميع الأنواع. 16 نظرياً، نشاط جميع ردود فعل مختلفة من نازعة يمكن بشكل منفصل بالتحقيق اللف البروتوكول الأيضية رسم الخرائط الموضحة هنا. كل رد فعل الانزيمية فريدة من نوعها عن طريق الركيزة والعوامل المساعدة اللازمة لنشاطها. ولذلك، يمكن تحديد نشاط كل رد فعل الانزيمية استخدام تجربة تعيين ايضية مع الركازة الملائمة والعوامل المساعدة على المديين المتوسط ورد الفعل. بيد أن بعض isoforms الإنزيم تختلف في هذه الترجمة سوبسيلولار، مثل واحد isoform يحفز رد فعل في السيتوبلازم بينما isoform آخر يعمل في الميتوكوندريا. مثال جدير بالذكر هو IDH1 و IDH2، التي السابق هيولى وهذا الأخير mitochondrial واثنين من البروتينات المختلفة المشفرة بواسطة اثنين من جينات مختلفة. 11 1-ميثوكس-5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (ميثوكس-PMS) و 5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (PMS) يمكن استخدام كل كحاملات إلكترون لهذه التجارب. السابق لا يمر المتقدرية الأغشية، هذا الأخير. ولذلك، يجب استخدام التحقيقات على إنزيمات الميتوكوندريا (مثل IDH2) الدورة الشهرية بينما التحقيقات على إنزيمات سيتوسوليك (مثل IDH1) وينبغي أن تستخدم مبمس.
كما هو الحال مع العديد من التقنيات، اختلافات من هذا البروتوكول، مثل استخدام أنواع مختلفة من الأملاح تيترازوليوم، باستثناء إضافة الدورة الشهرية وأزيد الصوديوم، استخدام وسيلة متزايدة مائي، واختلاف الاحتضان والشطف مرات، موجودة، وقد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. لا يقتصر تطبيق رسم الخرائط الأيضية مع أملاح تيترازوليوم إلى ديهيدروجيناسيس. مع تعديلات صغيرة إلى البروتوكول، يمكن أيضا استخدامه لتقييم نشاط الإنزيمات التي تعمل مباشرة المنبع لنازعة في مسار الأيض. لقد قمنا سابقا بوصف هذا المبدأ للانزيم جلوتاميناسي،17 التي تعمل مباشرة المنبع من نازعة غلوتامات في مسار جلوتامينوليسيس. 18 من الناحية النظرية، يمكن تطبيق نفس المبدأ للإنزيمات الأخرى أن دورة الدالة مباشرة المصب أو المنبع لنازعة مثل أكونيتاسي، التي تقع مباشرة أعلى النهر IDH2 و IDH3 في حامض تريكاربوكسيليتش (TCA). اختلاف بسيط آخر هو التركيز المبينة في الجدول 1 عن طريق جعل حضانة قنينة متوسطة بتركيزات مختلفة من الركازة، مساعد و/أو مثبط. يسمح هذا جيل منحنيات جرعة النشاط كدالة لتركيز الركازة، مساعد و/أو تثبيط.
يتحدث من الناحية الفنية، الأيضية والتجارب رسم الخرائط لا تيسر الملاحظات غير متحيزة في الموقع نشاط الإنزيم، للباحثين لاختيار تركيز الركيزة ومساعد قد لا تعكس مستويات الركيزة ومساعد أن يتم هذا في الموقع. وعلاوة على ذلك، استخدام لزج 18% بولي في الأجلين المتوسط ورد فعل يساعد على إبقاء الجزيئات سليمة، في المكان وفي تكيف ولكن يحظر نشر فعالة من الكواشف الوزن الجزيئي المنخفض من خلال وسيلة رد فعل. 3 , 5 ولذلك أنشطة إنزيم العزم في التجارب الموضحة هنا أن استخدام تركيزات الركيزة سوبرافيسيولوجيكال لا تعكس الحالة في فيفو بتركيز الركازة معين بل مناسبة مقارنات بين التجريبية. وبالتالي، من نتائج تجارب رسم الخرائط الأيضية قدرة الإنتاج (أقصى نشاط) فعل الانزيمية في السياق مستويات الركيزة ومساعد الموجودة على هذا الموقع. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام تركيزات مختلفة من الركازة و/أو العوامل المساعدة وعينات متعددة غير متحيزة مقارنة بالطاقة الإنتاجية القصوى (Vmax) وتقارب (كم) من إنزيم الركازة/مساعد في الأعمال التحضيرية للخلية ، الأنسجة أو مناطق الأنسجة. هذه المعلمات هي نتيجة لمجموع إنزيم البروتين التعبير والتعديلات بوستترانسلاشونال وأثر المكروية مزدحمة على نشاط الإنزيمات. ولذلك، تعيين الأيضية لا تزال انعكاسا أفضل لنشاط إنزيم من التجارب التي تحدد التعبير البروتين أو تنقية إنزيم النشاط في المختبر.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم R.J.M. “منحة الدكتوراه المجلس الطبي الأسترالي”. وأيد هذا البحث “جمعية السرطان الهولندية” (منحة كوف يوفا 2014-6839). يشكر المؤلفون جونكر ألف الدكتور لمساعدته مع كتابة البروتوكول.
Materials
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
参考文献
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
- Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
- Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. . Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).
- Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).
- Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. . Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).
- Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
- Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
- Matsumoto, B. . Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).
- Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
- Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
- Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
- Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. . 生化学. , (2015).
- Webb, E. C. . Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).
- Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
- van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).
