Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.
Genlerin hücre özerk nöronal işlevleri kaybına neden tarafından ortaya ya da küçük ve seyrek nüfus nöronların bir genin fonksiyonunun kazanmak. Bunu yapmak için hangi genetik olarak soğukkanlı doku tarafından nöronlar kaybı veya kilo alma işlevinin bir gen ile çevrili olan bir mozaik oluşturma gerektirir. Burada, biz Cre-lox rekombinasyon sistemi ile rahim içinde elektroporasyon nöronlar genlerin hücre özerk işlev eğitim için kullanılan mozaik beyin doku oluşturmak için birleştirmek. DNA yapıları (depoları ile kullanılabilir) bir floresan etiket ve Cre recombinase, kodlama, kortikal nöronlar içinde utero kullanarak fare embriyo beynindeki loxP siteleri ile çevrili genleri içeren gelişmekte içine tanıtıldı elektroporasyon. Ayrıca, biz survivability ve tekrarlanabilirlik artırmak çeşitli uyarlamalar rahim içinde elektroporasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda bir titresi Cre-aracılı rekombinasyon nöronların seyrek veya yoğun nüfus için oluşturma içerir. Etiketli beyin dokusu histolojik hazırlıkları gerektirmez (ancak için adapte edilebilir) immünhistokimya. Kullanılan yapıları bu fluorescently Cre recombinase için gen nöronlar taşımak etiketli garanti. Histolojik hazırlıklar nöronların confocal görüntüleme dendritik ve aksonal arbors ve dendritik spines ile morfolojik analiz sağlar. Seyrek mozaik doku kaybı veya kilo alma işlevinin elde çünkü bu yöntem hücre özerk gerekliliği, çalışma ve gen ürünleri içinde vivoyeterliliği izin verir.
Genetik bir mozaik üreten ilgi bir gen işlevini anlamak için deneysel bir klasik örnektir. Bir gen bir hücresel fenotip için gerekli olup olmadığını belirlemek için en basit yaklaşım organizma (örneğin nakavt) boyunca gen fonksiyon kaybına neden oluyor. Ancak, bir gen özellikle belirli bir hücre türü içinde gerekli belirlemek için nakavt gen organizma boyunca geçerli bir yaklaşım değildir. Bunun yerine, bir yöntem gereklidir bu-ecek neden bir gen fonksiyon kaybı belirli bir hücrenin wildtype (Yani genetik olarak soğukkanlı) doku tarafından çevrili iken — başka bir deyişle, mozaik doku oluşturma. Eğer bir mutant fenotip mutant hücre gösterir ama çevreleyen wildtype hücreleri hücre özerk bir şekilde gen fonksiyonları yok. Analiz mozaik doku, mutasyona uğramış hücreler wildtype doku ile çevrili olan genlerin, özellikle nerede neurons ve glia dokusunun geniş bir birbirine bağlı ağ oluşturmak beyin hücre özerk işlevleri anlamak için idealdir.
Mozaik beyin dokusunun birkaç form genlerin hücre özerk fonksiyonlarını araştırmak için güçlü modeller hazırladık. Çalışmalar nöronal nakli1‘ de, kadın X’e mozaizm2,3,4, odaklı ve endojen somatik mozaizm5,6 çizilmiş onların sonuçlar mozaik üzerinde dayalı beyin dokusu. Bir genin Cre-lox rekombinasyon sistemi aracılığıyla koşullu silme transgenik fare satırları büyük kullanılabilirliğini yararlanır bir yöntemdir. Bu yöntemde, iki loxP site gideriş o (“floxed”) aynı yönde iki yüz loxP siteleri tarafından çevrili bir gen (örneğin bir exon), gerekli bir dizi her iki tarafında tanıtılmaktadır. CRE recombinase loxP siteleri7arasında sıra excises. CRE-aracılı rekombinasyon geçiş floxed fareler Cre recombinase ile birlikte bir alt hücre (“Cre muhabir çizgi”) floresan işaretleyicisinde ifade başka bir fare çizgi için elde edilebilir. Bu işlevleri eksitatör nöronlar veya astrocytes8gibi hücrenin alt kümeleri içinde bir gen ortaya çıkarmak için yol çeşitli göstermiştir. CRE muhabir satırları Cre-aracılı rekombinasyon uyuşturucu indüklenebilir (tek-nöron indüklenebilir Cre-aracılı nakavt veya KAYGAN ile etiketleme) olmak izin vermek için CreERT2 ifade9. Mozaik analiz çift işaretleri (MADM)10,11ile adı verilen başka bir strateji, heterozigoz dokusu ile birlikte oluşturulacak homozigoz mutant interchromosomal rekombinasyon Cre-aracılı sağlar. Bu yaklaşımlar, farelerin yeni bir satır her aday gen ya da mercek altına alındı hücresel alt türü için her zaman üretilmesi gerekiyor. Alternatif olarak, Cre recombinase postnatally İyontoforez12 veya viral vektörler (hücresel alt türü özel taşıyanörneğin adeno ilişkili virüs13 ya da lentiviruses14 aracılığıyla tanıttı olabilir Organizatör). Bu strateji etiketleme güçlü ve postnatal oluşturur. Seyrek ve prenatally serebral kortikal nöronlar geliştirme hedeflemek için bir ideal Cre recombinase floresan bir marker ile rahim içinde elektroporasyon stratejisidir.
CRE-lox rekombinasyon üretmek için rahim içinde elektroporasyon ile birleştirerek yanı sıra doku vivo içindeMozaik, biz diğer yayımlanmış protokolleri15,16yordamları için çeşitli uyarlamalar tanıtmak, 17,18,19,20,21. Üreme zaman aşımına uğradı-hamile kadın başarısında geliştirmek için bilgi veriyoruz. Biz de seyrek ve parlak kortikal doku nöronlarda etiketlerine göre tanıtmak bizim iki strateji anahat: bir strateji bir tek yapı Cre recombinase ve floresan marker22için kodlama düzeyleri titre etmektir. Bu parametreler zihin23,24ile özel tasarlanmış “Süpernova” sistemini kullanmak için başka bir stratejidir. Ayrıca, biz tutarlı mikroenjeksiyon Pipetler ve basitleştirmeler rahim içinde elektroporasyon cerrahi üretmek geliştirmeleri sunar. Son olarak, biz daha fazla boyama ve immünhistokimya dendritik spines ve dendritik ve aksonal arbors, analizini verir basitleştirilmiş bir histolojik hazırlık kritik adımlar verilmiştir.
Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase mozaik beyin doku oluşturmak için floxed farelerde ile kombinasyonu tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, yeni bir fare satır farklı hücresel alt türü hedef için her zaman var olmak oluşturmak yeterli değil olmasıdır: rahim içinde elektroporasyon eksitatör nöronlar, inhibitör nöronlar veya glia süreye bağlı olarak hedeflemek için kullanılan ve konumu elektroporasyon15,16</sup…
The authors have nothing to disclose.
Yazar James Madison Üniversitesi Biyoloji bölümü ve James Madison Üniversitesi ışık mikroskobu ve tesis Imaging cömert destek teşekkür ederiz. Dr. Mark L. Gabriele için yararlı tavsiyeler genç doğum sonrası doku hazırlık, ilgili ve Drs. Justin W. Brown ve Corey L. Cleland cerrahi malzemeler ve mekan cömert koordinasyon için. Bu araştırma kısmen 4-VA, ilerleyen Virginia Commonwealth (G.S.V.) için işbirliğine dayalı bir ortaklık tarafından ve tarafından bir Virginia Akademisi bilim küçük proje araştırma Grant’ın (G.S.V.) bir ortak araştırma hibe tarafından finanse edildi. Destek cömertçe sağlanmıştır Betty Jo sevgi dolu Butler 58 ‘ bağış tarafından lisans araştırma bursu (için K.M.B.), Farrell yaz araştırma bursu (için K.M.B.), James Madison Üniversitesi ikinci yüzyıl burs (K.M.B.), James Madison Üniversitesi Centennial burs (C.J.H.), James Madison Üniversitesi Lucy Robinson arama ‘ 30 Memorial burs (Z.L.H.) ve James Madison üniversiteler, bilim ve matematik Fakültesi yardım Grant (için G.S.V.).
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |