Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

La generación de un mosaico genético, es un paradigma experimental clásico para entender la función de un gen de interés. Para determinar si un gen es necesario para un fenotipo celular, el enfoque más sencillo está causando una pérdida de función del gen en el organismo (por ejemplo, knockout). Sin embargo, para determinar si un gen se requiere específicamente en un determinado tipo de célula, golpe de gracia del gene en el organismo no es un enfoque válido. En cambio, se requiere un método que causará la pérdida de función de un gen en una célula determinada, mientras que está rodeado por tejido de tipo salvaje (es decir, genéticamente imperturbable), en otras palabras, crear tejido mosaico. Si la célula mutante muestra un fenotipo mutante, pero no las células circundantes de tipo salvaje, las funciones del gene de una manera autónoma de células. Análisis de tejido de mosaico, en el que las células mutantes están rodeadas por tejido de tipo salvaje, es ideal para la comprensión de la célula autónoma funciones de genes, especialmente en el cerebro donde las neuronas y glia forman una vasta red interconectada de tejido.

Varias formas de tejido cerebral de mosaico han proporcionado poderosos modelos para investigar la célula autónoma funciones de genes. Estudios se centraron en el trasplante neuronal¹, mosaicism ligadas al cromosoma X femenino^2,3,4, y mosaicism somático endógena^5,6 han extraído sus conclusiones basados en mosaico tejido cerebral. Supresión condicional de un gen a través del sistema de recombinación del Cre-lox es un método que aprovecha la gran disponibilidad de líneas de ratón transgénico. En este método, se introducen dos loxP sitios a ambos lados de una secuencia necesaria de un gen (como un exón), dejándola flanqueado por sitios loxP que enfrentan a ambos en la misma dirección (“floxed”). Recombinase de CRE accisas la secuencia entre la loxP sitios⁷. Recombinación mediada por la CRE se logra por los ratones de floxed paso a otra línea de ratón expresan recombinase de Cre junto con un marcador fluorescente en un subconjunto de células (“línea de la reportera de Cre”). Esto se ha demostrado en una variedad de maneras para descubrir las funciones de un gen en subconjuntos de células como neuronas excitatorias o astrocitos⁸. Líneas de reportero de CRE pueden expresar CreER^T2 para permitir la recombinación mediada por la Cre a ser droga-inducible (solo-neurona etiquetado con knockout inducible Cre-mediada, o SLICK)⁹. En otra estrategia llamada análisis de mosaico con doble marcadores (MADM)^10,11, Cre-mediada intercromosomal recombinación permite un mutante homocigótico para crearse junto con tejido heterozigótico. En estos enfoques, una nueva línea de ratones debe ser producido cada vez para cada gen candidato o subtipo celular que se ha probado. Por otra parte, recombinase de Cre puede introducirse postnatal a través de iontoforesis¹² o vectores virales (e.g. virus adeno-asociados¹³ o lentivirus¹⁴ llevar celulares específicos de subtipo promotores). Esta estrategia crea fuerte y postnatal de etiquetado. Para desarrollar las neuronas corticales cerebrales escasamente y prenatally, una estrategia ideal es en el útero la electroporación del recombinase de Cre con un marcador fluorescente.

Además de combinar la recombinación del Cre-lox a través de electroporación en el útero para producir mosaico tejido en vivo, introducimos varias adaptaciones a los procedimientos de otros protocolos publicados^{15,16, 17,18,19,20,21}. Proporcionamos información para mejorar el éxito en las mujeres embarazadas en tiempo de cría. También describiremos nuestros dos estrategias para introducir rala y brillante etiqueta de neuronas en el tejido cortical: una estrategia es valorar los niveles de una construcción única codificación recombinase de Cre y un marcador fluorescente²². Otra estrategia es utilizar el sistema de “Supernova”, diseñado específicamente con estos parámetros en mente^23,24. Además, nos ofrecen mejoras en la producción de microinyección consistente pipetas y simplificaciones a la cirugía en el útero la electroporación. Finalmente, describiremos los pasos críticos en un preparado histológico simplificado que permite el análisis de espinas dendríticas y cenadores dendríticas y axonales, sin más manchas o inmunohistoquímica.