Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.

Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal¹, mosaicismo feminino ligado ao X^2,3,4, e mosaicismo somático endógena^5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção (“floxed”). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP⁷. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células (“linha de repórter de Cre”). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos⁸. Linhas de repórter CRE podem expressar CreER^T2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)⁹. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)^10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese¹² ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado¹³ ou lentivírus¹⁴ carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.

Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados^{15,16, 17,18,19,20,21}. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente²². Outra estratégia é usar o sistema de “Supernova”, projetado especificamente com esses parâmetros em mente^23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.