Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Het genereren van een genetische mozaïek is een klassieke experimentele paradigma voor het begrijpen van de functie van een gen van belang. Om te bepalen als een gen noodzakelijk voor een cellulaire fenotype is, wordt de eenvoudigste aanpak veroorzaakt door een verlies van functie van het gen in het organisme (bijvoorbeeld knock-out). Om te bepalen als een gen specifiek in een bepaalde celtype vereist is, is knock-out van het gen in het organisme echter niet een geldige benadering. In plaats daarvan een methode is verplicht die zal leiden tot het verlies van functie van een gen in een bepaalde cel terwijl het wordt omringd door wildtype (dat wil zeggen genetisch onverstoorbaar) weefsel — met andere woorden, het maken van mozaïek weefsel. Als de gemuteerde cel een mutant fenotype toont, maar omringende wildtype cellen niet, de functies van het gen in een cel-autonome wijze. Analyse van mozaïek weefsel, waarin mutantcellen zijn omringd door wildtype weefsel, is ideaal voor het begrijpen van de cel-autonome functies van genen, met name in de hersenen waar neuronen en glia een uitgebreid, onderling verbonden netwerk van weefsel vormen.

Verschillende vormen van mozaïek hersenweefsel hebben verstrekt krachtige modellen om te onderzoeken van cel-autonome functies van genen. Studies gericht op neuronale transplantatie¹, vrouwelijke X-gebonden mozaïcisme^2,3,4, en endogene somatische mozaïcisme^5,6 hun conclusies op basis van mozaïek hebben getrokken hersenweefsel. Voorwaardelijke schrapping van een gen door middel van de Cre-lox recombinatie systeem is een methode die volledig gebruik van de grote beschikbaarheid van transgene muis lijnen maakt. Bij deze methode worden twee loxP sites geïntroduceerd aan weerszijden van een vereiste sequentie van een gen (zoals een exon), waarbij het geflankeerd door loxP sites dat beide in dezelfde richting (“floxed”) worden geconfronteerd. CRE recombinase excises de volgorde tussen de sites loxP⁷. CRE-gemedieerde recombinatie kan worden bereikt door Overstekende floxed muizen naar een andere muis lijn uiting van Cre recombinase samen met een fluorescerende marker in een subset van cellen (“Cre verslaggever lijn”). Dit is aangetoond in een verscheidenheid van manieren om de functies van een gen in subsets van cellen, zoals de excitatory neuronen of astrocyten⁸bloot te leggen. CRE verslaggever lijnen kunnen uitdrukken CreER^T2 zodat Cre-gemedieerde recombinatie als drug-afleidbare (single-neuron labelen met afleidbare Cre-gemedieerde knockout of SLICK)⁹. In een andere strategie genaamd mozaïek analyse met dubbele markeringen (MADM)^10,11, laat Cre-gemedieerde interchromosomal recombinatie een homozygoot mutant naast heterozygoot weefsel worden gemaakt. In deze benaderingen moet een nieuwe lijn van muizen worden geproduceerd elke keer voor elke kandidaat-gen of cellulaire subtype dat wordt getest. Als alternatief, Cre recombinase kan worden ingevoerd postnatale stadium manifesteren door middel van Iontoforese¹² of via virale vectoren (b.v. virussen adeno-geassocieerde¹³ of lentivirussen¹⁴ cellulaire subtype-specifieke uitvoering initiatiefnemers). Deze strategie maakt sterke en postnatale labeling. Te richten op ontwikkeling van cerebrale corticale neuronen dunbevolkte en geïnduceerd, is een ideale strategie in utero electroporation van Cre recombinase met een fluorescerende marker.

Naast het combineren van Cre-lox recombinatie door in utero electroporation te produceren mosaic weefsel in vivo, we verscheidene aanpassingen kennismaken met procedures van andere gepubliceerde protocollen^{15,16, 17,18,19,20,21}. Wij bieden informatie om succes in de getimede-zwangere vrouwelijke fokdieren. Wij ook een overzicht van onze twee strategieën in te voeren schaars en heldere labeling van neuronen in de corticale weefsel: een strategie is om de niveaus van een enkele construct codering voor Cre recombinase en een fluorescerende marker²²Titreer. Een andere strategie is het gebruik van de “Supernova”-systeem, ontworpen specifiek met deze parameters in gedachten^23,24. Daarnaast bieden wij verbeteringen op het produceren van consistente microinjection pipetten en vereenvoudigingen van de in utero electroporation operatie. Tot slot schetsen we kritische stappen in een vereenvoudigde histologisch preparaat dat de analyse van dendritische spines en dendritische en axonale arbors, zonder verdere kleuring of immunohistochemistry toelaat.