Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Adımlar da dahil olmak üzere tüm yordamları hayvan konularıyla ilgili, hayvanları Etik Komitesi (Regierungspräsidium Karlsruhe) tarafından onaylanmış ve Heidelberg Üniversitesi hayvan bakımı yönergeleri izleyin. 1. sabitleştirici hazırlanması (% 4 İngiltere’de yılın/PBS) Sabitleştirici taze her gün histolojik doku bütünlüğünün en uygun koruma sağlamak için hazır olun. Sodyum hidroksit (NaOH) 0.2 gram oda sıcaklığında sürekli karıştırarak 90 mL Çift Kişilik distile su içinde (GKD2O) geçiyoruz. 4 g paraformaldehyde (PFA) ekleyin ve çözüm oluştururlar bozulumu sağlamak için en az 5-10 dk için tamamen temizlenene kadar karıştırın.Dikkat: PFA toksik, dikkatli. Çözümde 0.84 gr sodyum dihydrogen fosfat (NaH2PO4) dağıtılması ve pH 7.2 ile ölçüm, kontrol. GKD2O ile 100 mL için ses seviyesini ve seviye 3 filtre kağıdı ile çözüme filtre. Saklamak % 4 İngiltere’de yılın/PBS buz üzerinde. 2. ötenazi çözüm hazırlanması Not: Aşağıdaki adımları ABTL vahşi tipi Zebra balığı gerilme ile 6-8 Pzt genel bir yaşta yapıldı. Etil 3-aminobenzoate metan Sülfonat, ayrıca “tricaine” veya MS-222, 0.31 mg/mL Zebra balığı ötenazi16için bir konsantrasyon adlı kullanın. Zebra balığı embriyolar, ötenazi çözüm için solvent olarak yükseltmek için kullanılan 1 x yumurta su kullanmaktadır. Genel olarak, denge kaybı göstererek uyuşturulan balık ile çalışmaya başlamadan önce doğru anestezi derinliği kontrol ve reaksiyon kaybı dokun. 10 yumurta su x 1000 mL ulaşmak için bu tuzları 1000 mL Çift Kişilik distile su (GKD2O) aşağıdaki sıraya göre sürekli karıştırarak ekleyin: 10 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.4 g CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2O. 3. Zebra balığı doku fiksasyonu 6 mL % 4 İngiltere’de yılın/PBS çözüm örnek başına önceden altı-şey plakaları kuyu aktarın. (Daha önce bir standart ışık günlük döngüsü, örneğin, 12 h 12 h muhafaza) Yetişkin Zebra balığı ötenazi ışıklar tricaine çözümünde yerleştirerek sabah açmak ve onlar ötenazi gelinceye beklemek sonra 2s. Opercular hareketi kesilmesi, hangi 10 dakikaya kadar sürebilir. Tricaine ötenazi çözüm çıkmış balık alıp taze kağıt havlu üzerine koy. Kuru balık ve operculum arkasında kafa kesmek için bir neşter kullanın (bkz. şekil 2A). Kafaları taze hazırlanmış sabitleştirici içeren doğrudan hazırlandı iyi kalıplara, aktarın. Balık kafası 4 ° C’de içeren iyi plakaları sabitleştirici sağlamak en az 24 Saat gece mağaza derin retina katmanları nüfuz eder.Not: En fazla 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) ilgili bir kaybı olmadan hazırlanması Floresans sinyal gücü önce 4 ° C’de x 48 h Zebra balığı kafaları depolanabilir. Artan gecikme süresi doku bütünlüğü kaybına yol açabilir ve görüntü kalitesi azalır ve böylece kaçınılmalıdır. 4. Zebra balığı retina damarlara hazırlanması Petri kabına ilâ üçüncü ısıtmalı % 2 özel ile doldurun ve agar firma tamamlanana kadar bekleyin. Gözleri incelemek için bir çalışma alanı oluşturmak için 1 x PBS agar plakalı kapsar.Not: Bu hazırlık cımbız ve düşük basınç her iki korunması doku üzerinde diseksiyon sırasında yapısal hasar olasılığını azaltmak sağlar. #5 düz forseps ek epi-aydınlatma diseksiyon mikroskop altında iyi ipuçları ile kullanarak bu çalışma alanındaki tüm daha fazla hazırlık adımları gerçekleştirilmesi gerekiyor. Diseksiyon sırasında 6.0 x arasındaki 4.0 x büyütme genel bakış ve doku detay odaklı değerlendirilmesi için izin vermek için kullanın. Sabit örnek petri kabına aktarmak ve bir cımbız ile kesme yüzeyi başından tutarak, göz küresi aşağıda başka bir tuş-birlikte cımbız yörünge boşluğu eklemek. Yavaş yavaş cımbız göz altında açın ve optik sinir kavrama o zaman dikkatle gözyaşı ve gözleri (şekil 2B) bağlantısını kesin. Şekil 2: Yetişkin Zebra balığı göz kaldırılması. Gözlerime hala yörünge kavite ve bozulmamış Optik siniri (A)ile kornea yan görünüm. Müstakil göz (B)ile kornea yan görünüm. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Dört rektus ve hala göz hem de kalan Gözdışı doku göz yörünge kavite bağlama bağlı iki eğik Ekstraoküler kaslar kaldırabilir ( şekil 3 ve şekil 4karşılaştırın). Bu yarı-kapalı cımbız gözünden geri tutarak ulaşmak ve yapısı diğer cımbız ile sürükleyici, yumuşak bir diametric hareketi ile rip. Bu yana doğrudan göz küresi sürükleyici iç gemi kırılması yol açar, bu damarlara korumak için uygun bir şekilde yumuşak bir tekniktir. Şekil 3: Yetişkin Zebra balığı göz Ekstraoküler kaslar odak ile. Yan görünümü oküler dünyanın odak (A)sol dış kenarında bir Ekstraoküler kas eki ile. Optik sinir yan görünüm Ekstraoküler kaslar simetrik olarak Optik siniri (B)kanat ile. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Kornea (şekil 4 c, kırmızı ok) dış mesafeden ponksiyon için 27 G (0,4 x 19 mm) tek kullanımlık iğne kullanın. Bu delikten kornea her iki cımbızla tutup da biraz açık gözyaşı. Daha sonra dikkatli bir şekilde ortalanmış bir gözyaşı ilgili öğrenci yaklaşık boyutu oluşturmak için çalışıyorum. Şekil 4: Yetişkin Zebra balığı göz tüm Ekstraoküler kaslar çıkarıldıktan sonra. Yanal göz temizlenen dış kenarında manzaralı küre görünür (A).Optik sinir yan görünümü ile optik sinir ortada. Işık yansıtan sklera sinir (kırmızı Kesikli çizgi) bütün çevresini kapsayan (B). (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Gözü yukarıda kornea dış kenarında oküler dünya (bulbus lateralis) kornea tarafındaki basınç uygulayın. Bu küçük bir göçük oluşturur ve lens kornea gözyaşı yüksekliğini itin. Cımbız mercek altında çalıştırmak ve (şekil 5A) çıkarın. Şekil 5: Yetişkin Zebra balığı göz lens temizleme sürecinde. Kornea yan görünüm lens ile kornea gözyaşı (A)ile itti. Kornea yan görünüm yanında oküler dünya (B)lens ile. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Baş aşağı için araştırmacı karşı karşıya optik sinir göz yummak. Sklera ve kornea bağlı ve fibröz tunik göz ampul Kupası şeklindeki retina korumak için form not. (Şekil 6). Kornea ve sklera, oluşan bu kabuk, “corneosclera” ve yedek parça dışarı Optik siniri (şekil 4B, kırmızı Kesikli çizgi) çevresi olarak da adlandırılır. Bir iğne sklera ve retina arasında bir boşluk oluşturmak için bir kez bu kesilmesi ekleyin. Şekil 6: oluşan sklera ve kalan göz içi dokusundan kesilir kornea Corneosclera. Yarı saydam kornea devamı Pigmentli sklera (A)içine gösterilen kornea yan görünüm. Yan görünümü (B)corneosclera scleral parçası üzerinde duruldu. Kaldırılan corneosclera (C)şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Bu erişim her iki cımbız ile kullanarak, dikkatle sklera eksenel çizgili Optik siniri çevresinde açılış artırmak için içine rip. Kornea yan çevresi geçiş, corneosclera sağlam tutmak için dikkatli olun (bkz. şekil 6A). Bir cımbız ile ve diğer optik sinir kapma tarafından sklera tutun ve uzak çekerek, tamamen corneosclera gözünden kaldırmak ve (şekil 6) atmak. Diğer yapılar için ek bir kritik nokta olarak herhangi bir bağlantıları corneosclera ve kalan göz içi doku ayıran önce koparmaya deneyin; Bu adımı uvea ve retina retina damarlara (Şekil 7) içeren oluşan bir fincan şeklindeki yapısı sağlar. Bir kopma iğne ucu RIM ile dış yüzey kazıma süre kalan Kupası 27 G iğne yana doğru tutarak choroidal/RPE katmanında oluşturun. Kopma choroidal/RPE katmanda topla ve şeritler her iki cımbız ile rip ama gözü bağlantısı sağlam tutmak için bir erişim noktası olarak kullanın. Daha sonra bir cımbız iris altında çalıştırmak ve dekolmanı kombine yapısının ulaşmak için üretilmiyor choroidal/RPE katmanında çekerek gerginlik oluşturulurken dışarıdan bir devre dolaşmak.Not: İris, gemiler (şekil 8B) görüntülenmesi sırasında Floresans engel değil böylece kesilmelidir. Gözü hala çevreleyen doku bağlı olduğu doğrudan kaldırmak için gözü kapma kapsamlı gemi hasar, özellikle de iç optik Daire (IOC), yol açabilir. Choroidal katman ve retina Pigmentli epitel (RPE) ayrılmış olabilir ve genellikle bir bağlantı için kolay bir ikincil çıkarma olanağı verdiğinden gözü korumak. İris bölümlerini kaldırılamazsa, doğal bir kırılma noktası yetişkin Zebra balığı göz photoreceptor katman (PL), içinde sergiler gözü kaldırmak için adım 4,9 için benzer bir şekilde kullanmaktadır. Discontinuations (şekil 11C, siyah oku) kırılma noktası yukarıda pl ikna etmek için kalan Kupası şeklindeki retinanın dış üzerinde kazı. Oluşturulan erişim katmanı üst kısmındaki iris olası bağlantısı olduğu gibi tutmak kaldırmak için kullanın. Daha sonra cımbız iris altında çalıştırmak ve kombine yapısı ayırmak için daha önce belirtildiği gibi bir devre dolaşmak.Not: Bir sabır gibi tüm adım 4,9-ebilmek var olmak zor, ama bu bakım delikanlı Iris adlı öğrencinin RIM kapma veya choroidal/RPE bağlantıları yok ederek bir açılış zorlayarak daha bir daha iyi damar sonuca ulaşmak için çalışılmalı veya onların anılan sıraya göre kaldırma olmadan photoreceptor katman. Bu adımı takip böylece retinal damar bütünlüğünün korunması, ancak dış retina katmanları zarar neden. Şekil 7: Yetişkin Zebra balığı göz corneosclera çıkarıldıktan sonra. Lateral görünüm kalan göz içi dokusu bozulmamış iris ve optik sinir (A)ile gösterir. Odak (B)iris ile kornea yan görünüm. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Mikrodiseksiyon bahar makas bir düz 2.5 mm kesme kenarı ile retina olabildiğince yakın olarak Optik siniri kesmek için kullanın; Bu bir daha iyi düz montaj için dokunun sağlayacaktır. Şekil 8: Yetişkin Zebra balığı göz RPE/koroid ve kesilmiş optik sinir çıkarıldıktan sonra. Optik sinir yan görünüm retina kesilmiş bir Optik siniri (A)ile gösterir. Kornea yan görünüm retina (B)en iç tabakası üzerine doğrudan bir bakışla. (C)Bu adımda Zebra balığı göz şematik gösterimi.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 5. retina damarlara montajı 5 dakika içinde 1 x PBS için iki kez disseke retina yıkayın. Retina Optik siniri kesme sonra aktarmak için bir laboratuvar spatula doğrudan maruz kalan doku kullanımı önlemek için bir mikro kaşık ucu ile kullanmaktadır. PBS bir damla bir cam slayt üzerine yerleştirin ve retina damlacık aktarın. Doku Kupası şeklindeki yapısı düz dört-petal veya beş-petal şekil retina boyutuna bağlı olarak oluşturmak için bir neşter ile kesim sırasında tutmak için bir cımbız kullanın (bkz. Şekil 9). İyi bir kağıt parçası ile kalan PBS emmek. Retina dokunmamaya dikkat et. Montaj medya ve bir coverslip ile kapak düz monte retinada kat. Hava kabarcıkları retina damarları görselleştirme deforme edebilirsiniz gibi köpük, yaratmak için değil dikkatli olun. Coverslip hareketinin en aza indirmek ve açık oje ile kapak mühür. 6. retina damarlara görselleştirme Zaman aralığı arasındaki hazırlık ve görselleştirme resim detay kaybı ile floresan sinyal kaybı azaltmak mümkün olduğunca kısa tutmak. 4 ° C’de doğrudan görselleştirme elde edilemez, fotoğraf kalitesinde bozulma görünür 48 h hazırlık sonra yavaş yavaş olduğunda sinyal kaybı, azaltmak için hazırlanan retina damarlara bağlar saklar. Floresans mikroskobu ile retina damarlara bağlar görselleştirmek veya tarama confocal mikroskobu lazer.Not: 2.5 x büyütme 2.0 s, 6.0 x ve gama ve kazanç bir çekim hızı ile gemi görselleştirme Floresans mikroskobu tarafından elde edildi 1.67 ayarlar. Confocal mikroskopi için bir Ar-lazer (488 nm/20 mW) % 20 güç bir TD 488/543/633 uyarma filtre, bir 20 x / 0.7 birlikte kullanılmıştır NA çok daldırma amacı ile GKD2O daldırma medya ve emisyon filtre ayarları 505-560 nm olarak. Confocal resimler retina boyutuna bağlı olarak bir kiremit tarama ile birlikte 4 x 4, 4 x 5 veya 5 x 5 tekil görüntü oluşur. 7. O bölümler Zebra balığı retina Not: Zebra balığı retina o bölümlerini için doku iletişim kuralında adım kadar 4.5 açıklandığı şekilde hazırlayın ve daha sonra doğrudan adıma 7.1 atlayın. 5 dakika içinde 1 x PBS için iki kez (sonra adım 4.5) enucleated gözleri yıkayın. Daha sonra doku % 70 etanol (alkol) aktarın. Bu noktada, hazırlanan gözleri 4 ° C’de parafin katıştırma kadar saklanabilir. Doku parafin katıştırma önce kurutmak için aşağıdaki şekilde yıkamak: 2 x 15 dk etanol, 2 x 15 dk % 90 etanol, 3 x 15 dk % 96 etanol, 3 x 15 dk % 99 etanol, 2 x 15 dk acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 dk aseton içinde içinde içinde içinde içinde içinde. Doku içinde parafin 62 ° C’de gecede tutun. Taze parafin 62 ° c kadar ısı ve kalıpları katıştırma içine dökün. Doku doğrudan kalıpları içine ve hızı, gözleri denetimi doğru yönünü hızlı istediğiniz bölüm için de aktarın. Daha sonra gömme bir kaset kalıp ve ek ısıtmalı parafin ile kapak için geçerlidir. Parafin blok soğutmalı sonra gömme kalıpları kaldırın. Parafin blok bir microtome 10 µm bölümler halinde kesin ve onları 45 ° C su banyosu onları tamamen düzleştirmek yeterince su yüzeyi üzerinde yüzer. Bir cam slayt bölümlerde yakalamak ve onları dikey olarak aşırı su onları gecede kurutma önce 45 ° C’de bir fırında kaldırmak için drenaj Bölümleri daha da deparaffinize için aşağıdaki zamanlamayı ve o leke ile işlem: 4 x 1 min xylol, 1 x 1 min % 99 etanol, 1 x 1 min % 96 etanol, 1 x 1 dk etanol, 1 x 1 min % 70 etanol, GKD2O, Mayer’ın Hematoksilen dk 1 x 4 1 x 1 dk içinde içinde içinde içinde içinde , 1 x 10 dk GKD2O, 1x2min % 0.5 Eozin, 1 x 30 içinde GKD2O, 1 x 30 s s % 80 etanol, 2 x 30 s % 96 etanol içinde % 99 etanol, 3 x 1 min ve 1 x 1 dk içinde xylol. Cam slayt xylol dışarı almak ve hızlı bir şekilde ortam takma ile doku kapsar. Tamamen kurumasına, sonra bir coverslip üstüne yerleştirin ve lekeli doku mühür dokusu izin kaçının.