概要

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Published: March 03, 2018
doi:

概要

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

Abstract

불 임 클리닉 발달 유능한 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO2시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.

Introduction

여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.

암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.

Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)3로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이3,,45,6,7,8 표시 ,9, meiotic 및 발달 그들의 능력을 포함 하 여. 난소에서 분리 하 고 생체 외에서성숙 하는 때 모두 oocytes의 MII 무대를 입력 하 고 정자 수정 후 2-셀 단계로 개발 하지만 SN chromatin 조직 들만 기간9를 개발할 수 있습니다. 비록 좋은 유능한 무능 한 oocytes를 선택 하기 위한 분류 방법으로, 주요 단점은 자체 형광 색소와 무엇 보다도 자외선의 검색에 사용 되는 셀에 있을 수 있는 돌연변이 효과.

모든 이러한 이유로, 우리는 동일한 높은 분류 정확도 유지 하면서 Hoechst의 사용을 대체할 수 있는 SN 또는 NSN chromatin 구조와 관련 되었던 다른 비-침략 적 표시에 대 한 검색. 세포질 운동 속도 (CMVs)의 경과 관찰 셀 상태의 독특한 기능으로 떠오르고 있다. 예를 들어 최근 학문 CMVs 사이 협회 기록 수정 시간과 완료 preimplantation 및 전체 용어 개발10,11마우스 및 인간의 zygotes의 용량에서 설명 했다.

이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리가 여기 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes5,6,,78의 인식에 대 한 플랫폼을 설명 합니다. 플랫폼 기반으로 세 가지 주요 단계: 1) Oocytes antral 낭에서 격리는 먼저 둘러싸여 핵소체 (SN) 또는 아닙니다 포위 핵소체 (NSN); 그림 뿐만 아니라 그들의 chromatin 구성 중 하나에 따라 분류 각 단일 oocyte의 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 CMVs의 2) 시간 경과 이미지 촬영 및 분석 입자 이미지 velocimetry (PIV); 그리고 3) PIV와 얻은 데이터 분석으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 맹인 분류12,13. 우리는 그것을 테스트 하 고 다른 포유류 종 (예, 소, 원숭이 및 인간)에 대 한 사용 가능한 준비 하도록 마우스에 대 한 설계 절차의 가장 중요 한 단계의 세부 정보를 준다.

Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다. 1. 난소 격리 Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사. 46-48 h를 기다립니다. Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg…

Representative Results

그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지. 분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 …

Discussion

하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 가능한 덕분에 의해 지원 되었다: 파 비아 대학 FRG 2016; 파 르 마 대학 FIL 2014, 2016; 그리고이 연구를 수행 하는 데 필요한 plasticware 공급에 대 한 자세. 닥터 쉐 인 윈저 (공학 부, 브리스톨 대학, 영국)는 Cell_PIV 소프트웨어를 제공 하는 감사 합니다.

Materials

Folligon Intervet A201A02 Hormonal treatment
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich B2261 For oocyte heterochromatin staining
Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm  Corning  430165 For COCs isolation
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red Merck-Millipore MR-015-D For COCs isolation
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax  Sigma-Aldrich M4526 For oocyte in vitro maturation
Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom  WillCo  GWSt-3522 For imaging experiments
BioStation IM-LM  Nikon MFA91001 Live cell screening system 
Pasteur pipette Delchimica Scientific Glassware 6709230 For follicles manipulation
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 To prevent contamination and medium evaporation
Penicillin / Streptomycin Life Technologies 15070063 To prevent medium contamination 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich ML16141079 For making up αMEM medium 
L-Glutamine  Life Technologies 25030 For making up αMEM medium 
Taurine Sigma-Aldrich T0625 For making up αMEM medium 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3310 For making up αMEM media
Sodium pyruvate  Sigma-Aldrich  P4562 For making up αMEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) Virbac Srl QN01AX9 For mice anesthesia
Cell_PIV sofware  Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK                 -                 -
MATLAB The MathWorks, Natick, MA                  - For multi-paradigm numerical computing

参考文献

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記事を引用
Cavalera, F., Zanoni, M., Merico, V., Bui, T. T. H., Belli, M., Fassina, L., Garagna, S., Zuccotti, M. A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes. J. Vis. Exp. (133), e56668, doi:10.3791/56668 (2018).

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