概要

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Published: March 03, 2018
doi:

概要

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

Abstract

מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.

Introduction

פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.

אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.

בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ’ oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.

מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.

בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ו ועדות אתיות ב אוניברסיטת פאביה. בעלי חיים היו נשמרים בתנאים של 22 מעלות צלזיוס, לחות האוויר 60% מחזור/כהה 12:12 h. 1. השחלה בידוד מזריקים intraperitoneally 2 4-ל-11 בת שבוע CD1 הנשי עכברים עם 10 U של זקיק מגרה הורמון עם מזר…

Representative Results

איור 2 מציג נציג התפתחותי מוסמך ולא יוצלח oocyte, בהתאמה בהתחלה (GV) ובסופו של דבר (MII) של ההליך IVM. IVM של העכבר לבגרות oocytes מתרחשת במהלך 15 h תרבות. התצפית זמן לשגות מתעדת את ההתקדמות של מיוזה ומזהה האירועים meiotic הגדולים, כולל GVBD את ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון. <p class…

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxa…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד”ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.

Materials

Folligon Intervet A201A02 Hormonal treatment
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich B2261 For oocyte heterochromatin staining
Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm  Corning  430165 For COCs isolation
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red Merck-Millipore MR-015-D For COCs isolation
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax  Sigma-Aldrich M4526 For oocyte in vitro maturation
Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom  WillCo  GWSt-3522 For imaging experiments
BioStation IM-LM  Nikon MFA91001 Live cell screening system 
Pasteur pipette Delchimica Scientific Glassware 6709230 For follicles manipulation
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 To prevent contamination and medium evaporation
Penicillin / Streptomycin Life Technologies 15070063 To prevent medium contamination 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich ML16141079 For making up αMEM medium 
L-Glutamine  Life Technologies 25030 For making up αMEM medium 
Taurine Sigma-Aldrich T0625 For making up αMEM medium 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3310 For making up αMEM media
Sodium pyruvate  Sigma-Aldrich  P4562 For making up αMEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) Virbac Srl QN01AX9 For mice anesthesia
Cell_PIV sofware  Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK                 -                 -
MATLAB The MathWorks, Natick, MA                  - For multi-paradigm numerical computing

参考文献

  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).

Play Video

記事を引用
Cavalera, F., Zanoni, M., Merico, V., Bui, T. T. H., Belli, M., Fassina, L., Garagna, S., Zuccotti, M. A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes. J. Vis. Exp. (133), e56668, doi:10.3791/56668 (2018).

View Video