Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen
概要
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.
Abstract
Axon verzweigen und Synapse Bildung sind entscheidende Prozesse für die Festlegung der genauen neuronale Schaltkreise. Während der Entwicklung bilden sensorische Thalamocortical (TC) Axone Zweige und Synapsen in bestimmten Schichten der Großhirnrinde. Trotz der offensichtlichen räumliche Korrelation zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung ist die kausale Beziehung zwischen ihnen kaum verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir vor kurzem eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in organotypischen Kokulturen entwickelt.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode besteht aus einer Kombination von organotypischen Coculture und Elektroporation. Organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde erleichtern, Genmanipulation und Beobachtung der axonalen Prozesse, Erhaltung der charakteristischen Strukturen wie laminar Konfiguration. Zwei unterschiedliche Plasmide Codierung DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) wurden Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation-Technik. Diese Methode erlaubt uns, individuelle axonalen Morphologien von TC Neuronen und ihren präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren. Die Methode aktiviert auch Langzeit-Beobachtung, der den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung offenbart.
Introduction
Die Thalamocortical (TC) Projektion in das Gehirn von Säugetieren ist ein geeignetes System, Axon Guidance und targeting Mechanismen zu untersuchen. Während der Entwicklung wachsen sensorische TC Axone in die kortikale Platte und Form Zweige und Synapsen bevorzugt in Schicht IV der primären sensorischen Bereiche in der Großhirnrinde1,2. Auch nach Gründung der grundlegenden Verbindungen sind abhängig von Veränderungen der Umwelt3,4axonalen Lauben und synaptischen Terminals umgebaut. Jedoch wie TC Axon Morphologie dynamisch geändert ist schlecht verstanden. Einer der Hauptgründe ist das Fehlen einer angemessenen Technik, strukturelle Veränderungen auf eine einzelne Zellenebene zu beobachten. Obwohl jüngste Entwicklungen in der Mikroskopie, wie zwei-Photonen-Mikroskopie, direkten Beobachtung von lebenden kortikale Neuronen in Vivoerlaubt haben, gibt es noch technische Einschränkungen für die Erfassung der gesamten TC Trajektorien5, 6. daher, in-vitro- Methoden für live Aufnahmen von TC Axone böte leistungsstarke Tools für Strukturanalysen der Axon verzweigen und Synapse Formation.
Unsere Gruppe zum ersten Mal gegründet eine statische Slice-Kultur-Methode mit durchlässige Membran7. Mit dieser Methode eine Ratte kortikalen Scheibe war mit einem sensorischen Thalamische Block cocultured und Lamina-spezifische TC Verbindungen wurden in diesem organotypischen Kokulturen7,8zusammengefaßt. Spärliche Beschriftung mit einem fluoreszierenden Protein weiter konnten wir beobachten, TC Axon Wachstum und Zweig Bildung9,10,11. Vor kurzem haben wir eine neuartige Methode zur gleichzeitigen Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in die organotypischen cocultures12. Um TC Axone und präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren, waren DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation organotypischen Coculture. Die aktuelle Methode morphologische Analyse des TC Axone erleichtert und ermöglicht eine langfristige Beobachtung, die verwendet werden können, um den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung zu zeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, Entwicklungsaspekte der wachsenden Axone anders als der TC Projektion11zu studieren. Zum Beispiel ermöglicht eine Kombination der kortikalen Stück Kultur und die Elektroporation Technik Visualisierung einzelner axonalen Morphologie der kortikalen Neuronen und langfristige Beobachtung9,18.
Mithilfe des aktuellen Protokolls können die Rollen von in…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken auch Gabriel Hand für kritisches Lesen.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
参考文献
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
