NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法
概要
CAEBV 患者から NK と T 細胞クローンを取得するための簡単な方法は、IL-2 の低用量末梢血の少量と高効率開発されました。
Abstract
リンパ腫またはリンパ増殖性症候群の患者から NK/T 細胞ラインを確立する記述されていた方法の数。これらのメソッドは、フィーダー細胞、血液の限り 10 ml 精製 NK または T 細胞または高用量 IL-2 の採用。本研究では、組換えヒト IL-2 (以上より 2)、添加と周辺機器を培養 T 細胞と NK 行血単核球 (PBMC) の確立する強力かつシンプルな戦略と手法を提案し、2 ml 全血の少しを使用しています。細胞は 2 週間で簡単に増殖できるし、3 ヶ月以上維持します。この方法では、高い成功率での 7 NK または T 細胞ラインが設けられています。このメソッドは、単純な信頼性、および CAEBV または NK/T 細胞リンパ腫のより多くのケースから細胞株を確立することに適用できます。
Introduction
エプスタインバー ウイルス (EBV) は、ユビキタスと感染 B 細胞だけでなく、T とナチュラル キラー (NK) 細胞、NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患 (LPD) とリンパ腫/白血病、eb ウイルス関連血球貪食などの原因となります。症候群、hydroa 水疱症のようなリンパ腫、胃癌 NK/T 細胞リンパ腫、鼻型、アグレッシブ NK 細胞白血病1,2,3。これらの中では重度の慢性アクティブ EBV (SCAEBV) 疾患、東アジアを中心にインシデントであるし、EBV 感染 T または NK 細胞4,5,6,のクローン性増殖によって引き起こされる LPD にいえる7、伝染性単核症 (IM) に存在する明らかな免疫不全なし-高 eb ウイルス DNA と同様に、持続的または反復的に, 発熱やみ、リンパ節腫脹、肝機能障害を含む症状でロードのような末梢血8,9。CAEBV 患者は、予後10,11, とその病因を持ち、EBV の役割は明確。したがって、細胞由来の NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫は、白血病の発生率が高いと NK または T 細胞の増殖との関係を誘発する eb ウイルスの機構解明細胞モデルとして非常に役に立つかリンパ腫。
日には、さまざまなテクニック12,13,14,15,16のいくつかの細胞株が設けられています。人間 NK 細胞ライン、NK-イースは、NK 細胞リンパ腫/白血病からフィーダーと 20U mL15あたりの濃度以上より 2 の存在下で、マウス間質細胞ラインと共培養によって設立されました。KAI3 は厳しい蚊刺アレルギー患者または自家リンパ芽球様細胞株 (LCL) と SCAEBV から別に樹立 NK 細胞フィーダー細胞と 100U/mL16以上より 2 の追加として、eb ウイルスによる B 細胞。SNK6 と SNT8 は、以上より 2 (700U/mL)12の高用量を追加することによって鼻 NK/T 細胞リンパ腫患者の腫瘍組織から派生しました。同様の手法で SNK 1 セルから CAEBV 患者の PBMC 培養 T 細胞を除去して 700U/mL 以上より 213,17を追加します。SNT13 と SNT15 は、cd 4 + および cd 8 + 細胞18の取り外しによって設立されました。これまでのところ、EBV-NK/T LPD 患者から他の T 細胞と NK の細胞株は、すべてこのメソッド19開発されました。
上記の既存の方法の欠点は、ためにクリニックでは非常に挑戦的な高用量 IL-2 や NK/T 細胞の浄化、限り 10 mL 全血の使用率の要件フィーダー細胞の雇用を含めるどの種類の細胞その EBV 潜伏を確認の必要性は、文化を始める前に感染します。主にアジアの子供たちに発生する CAEBV と、10 mL の血液はすべての地域で取得する容易ではないです。本研究では、フィーダー細胞せず rhIL2 の低用量と血中の 2 mL の量を使って CAEBV 患者 PBMC を培養 NK および/または T 細胞ラインを確立する高い成功率を持つ新しい単純なメソッドを開発しました。このメソッドの結果は、その高い効率性と時間の節約を証明しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは NK/T CAEBV 患者の全血から細胞を確立するための新たな手法を開発しました。既存の手法と比較して, この方法の主要な利点はそのシンプルさとその要件への血液の量が少ないの高い成功率と細胞生存率の良い条件を発揮します。さらに、eb ウイルスの定量法として、事前に潜伏感染細胞の種類消費より多くの血液と培養開始前に、の時間を考慮せず PBMC を培養 NK/T 細胞株?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事だった中国の国立科学財団 (から科学 (KFZD-SW-205)、戦略的な生物資源技術支援システムの中国科学アカデミー (CZBZX-1、ZSSB-004) の中国アカデミーのキーのプロジェクトによっておよび補助金によってサポートされて81401640) 上海自然科学基金 (14ZR1434800)。
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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