Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie
概要
Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.
Abstract
Een aantal methoden zijn beschreven om NK/T cellijnen van patiënten met lymfoom of proliferatieve syndroom geweest. Deze methoden die feeder cellen, gezuiverde NK of T cellen met maar liefst 10 mL bloed of een hoge dosis van IL-2. Deze studie presenteert een nieuwe methode met een krachtige en eenvoudige strategie om NK en T cel lijnen door het kweken van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met de toevoeging van recombinante menselijke IL-2 (rhIL-2), en zo weinig als 2 mL bloed gebruikt. De cellen kunnen verspreiden snel in twee weken en worden gehandhaafd voor meer dan 3 maanden. Met deze methode 7 NK of T cel lijnen gelegd met een hoog slagingspercentage. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar, en die van toepassing zijn tot het vaststellen van cellijnen van meer gevallen van CAEBV of NK/T-cel lymfoom.
Introduction
Epstein – Barr virus (EBV) is alomtegenwoordig en infecteert niet alleen B-cellen, maar ook T en natural killer (NK) cellen, waardoor een aantal EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten (LPD) en lymfoom/leukemie, zoals EBV-geassocieerde hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-achtige lymfoom, extranodal NK/T-cel lymfoom, nasale type en agressieve NK-cel leukemie1,2,3. Daaronder is ernstige chronische actieve EBV (SCAEBV) ziekte, die vooral in Oost-Azië incident, en die wordt nu beschouwd als een LPD veroorzaakt door klonen expansie van EBV-geïnfecteerde T of NK cellen4,5,6, 7, maar zonder de schijnbare immunodeficiëntie presenteren in klierkoorts (IM)-als symptomen waaronder koorts, hepatosplenomegaly, lymfadenopathie en lever dysfunctie aanhoudend of productlevering, evenals hoge EBV-DNA laden de perifeer bloed8,9. Patiënten met CAEBV hebben een slechte prognose10,11, en de pathogenese en de rol van de EBV is onduidelijk. Daarom, cellijnen afgeleid van EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten en lymfomen zijn zeer behulpzaam als cel modellen voor verduidelijking van het mechanisme van EBV NK of T-cel proliferatie en haar relatie met een hoge incidentie van leukemie geïnduceerde of lymfoom.
Tot op heden zijn verschillende cellijnen opgericht met verschillende technieken12,13,14,15,16. Een menselijke NK cellijn, NK-YS, ontstond uit de NK-cel lymfoom/leukemie, door samen met een muis stromale cellijn kweken als feeder, en in aanwezigheid van rhIL-2 bij een concentratie van 20U per mL15. KAI3 was een andere NK cellijn opgericht met ingang van patiënten met een ernstige mug allergie of SCAEBV met autologe lymphoblastoid cellijn (LCL), B-cellen getransformeerd door EBV, als feeder cellen en toevoeging van rhIL-2 at 100U/mL16. SNK6 en SNT8 werden afgeleid van tumor weefsels van nasale NK/T-cel lymfoom patiënten door toevoeging van hoge dosis van rhIL-2 (700U/mL)12. Met soortgelijke techniek was de SNK-1 cel van CAEBV patiënten, gekweekt uit PBMC door verwijderen van T-cellen en het toevoegen van 700U/mL van rhIL-213,17. SNT13 en SNT15 werden opgericht door CD4 +- en CD8 + cellen18te verwijderen. Tot nu toe, werden andere T-cel en NK cellijnen van EBV-NK/T LPD patiënten alle ontwikkeld met deze methode19.
De nadelen van de hierboven genoemde bestaande methoden omvatten de tewerkstelling van feeder cellen, de eis van een hoge dosis IL-2, of het gebruik van maar liefst 10 mL bloed, de zuivering van NK/T-cellen, die is een grote uitdaging in de kliniek worden de noodzaak om te verifiëren welke soorten cel dat EBV latent infecteert vóór begin aan cultuur. Zoals CAEBV treedt vooral op bij kinderen in Azië, is 10 mL bloed niet makkelijk te verwerven in alle regio’s. In deze studie ontwikkelden we een nieuwe eenvoudige methode met een hoog slagingspercentage om NK en/of T cel lijnen door PBMC kweken van CAEBV patiënten met een lage dosis van rhIL2 en een volume van 2 mL van volbloed zonder feeder cellen. De resultaten van deze methode gebleken zijn hoge efficiëntie en tijdwinst.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, heeft een nieuwe techniek voor de vaststelling van NK/T cellijnen van volbloed van CAEBV patiënten ontwikkeld. Vergeleken met de bestaande methoden, is het grote voordeel van deze methode zijn eenvoud en zijn eis van slechts een kleine hoeveelheid bloed, terwijl het vertoont een hoog slagingspercentage en goede voorwaarden voor de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien kunnen NK/T cellijnen worden vastgesteld door het kweken van PBMC zonder eerst te controleren de celtypes het EBV latent geïnfectee…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de sleutel projecten van Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategische biologische middelen technologie steunregeling van Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1 en ZSSB-004) en door subsidies van de National Science Foundation of China) 81401640) en Shanghai natuurwetenschappen Fonds (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
参考文献
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
