Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Macrofagen circuleren gespecialiseerde fagocytische cellen die detecteren, verzwelgen en degraderen van een buitenlandse deeltje in perifere weefsels, variërend van apoptotic cellen tot invasie van micro-organismen zoals bacteriën aanwezig. Oppervlakte receptor-gemedieerde erkenning van pathogen specifieke markers vaak aanwezig op het oppervlak van micro-organismen (bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen of PAMPs) leidt macrofagen een complexe reorganisatie van cellulaire membraan in om te omringen en phagocytize van de pathogeen-¹.

Het overspoeld pathogeen is vervolgens opgenomen door de macrofaag in een intracellulair vesikel bekend als phagosome. Door een reeks van kernfusie en kernsplijting evenementen met andere blaasjes zoals Endosomen en lysosomes verwerft de pathogeen-bevattende phagosome een reeks eiwitten die nodig zijn voor de afschaffing van de phagosomal inhoud. Daarom is de enzymatische samenstelling van de phagosome in de loop van dit proces, bekend als phagosome rijping²zeer variabel.

Kort na de fagocytose, de multimeric complexe vacuolar ATPase (v-ATPase) is opgenomen in het phagosome-membraan door fusie met Endosomen³. Dit complex maakt gebruik van ATP aan pomp protonen uit het cytosol naar het lumen van het phagosome⁴. Verzuring van de phagosome is essentieel voor de gebeurtenissen van de fusie met andere blaasjes⁵ en voor de activatie van een groot aantal pH-afhankelijke afbraakroutes enzymen⁶. Een ander multimeric enzymatische complex dat is snel gemonteerd op het phagosome-membraan is het complex van NADPH-oxidase (NOX). NOX complexe oxideert NADPH om te produceren van reactieve zuurstof soorten (ROS) die worden uitgescheiden in de phagosome lumen en die aanzienlijk bijdragen tot het doden van de overspoeld micro-organismen⁷.

Tijdens de eerste stappen van rijping presenteren phagosomes markeringen typisch zoals Rab5 en Rab7 van vroege en late Endosomen respectievelijk samen met de subeenheid₀ V van de v-ATPase-⁸. Fusie van phagosomes met lysosomen en laat Endosomen resulteert in de blootstelling van de phagocytized pathogen aan een breed scala aan hydrolytische enzymen zoals β-galactosidase⁹cathepsin proteasen en lipasen. Verzuring van de lumen is ook vereist voor de activering van deze enzymen. Bijvoorbeeld, is het splijten van cathepsin D voor de productie van de actieve korte vorm pH-afhankelijke¹⁰. Deze enzymen degraderen van het pathogene agens en bemiddelen van de productie van pathogen afkomstige korte peptides, die door de macrofaag grote histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen naar T cellen activeren een adaptieve immuunrespons¹¹gepresenteerd.

Vandaar, phagosome rijping is cruciaal voor de aangeboren immuunrespons en verbindt de aangeboren en adaptieve takken van het immuunsysteem. Het is geen verrassing dat de ziekteverwekkers geëvolueerd zijn strategieën om te overwinnen afschaffing door macrofagen door het hierboven beschreven proces van rijping van de phagosome. Bijvoorbeeld de intracellulaire bacteriën Mycobacterium tuberculosis jp Legionella pneumophila voorkomen dat phagosome rijping remmende v-ATPase vergadering en daaruit voortvloeiende lumen verzuring met^12,13 . Andere bacteriën, zoals Listeria monocytogenes of Shigella flexneri induceren porie vorming in het membraan van de phagosome te ontsnappen naar het cytosol^14,15. Aan de andere kant, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is het kundig voor wijzigen van de eigenschappen van de phagosome binnen de vacuole om te zetten in een geschikte locatie voor de replicatie-¹⁶. Dit vermogen maakt S. typhimurium een zeer interessant model te bestuderen van de pathogeen-gemedieerde inmenging van phagosome rijping.

S. typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. Typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en deel uitmaakt van phagosomes¹⁷. Sommige rapporten hebben eerder beschreven dat S. typhimurium-met phagosomes presenteren makers voor zowel Endosomen als lysosomen¹⁸, en andere studies hebben gevonden phagosome-lysosoom fusion voorkomen op S. Typhimurium infectie¹⁹.

In eerste instantie phagosome rijping op S. typhimurium infectie is onderzocht door immunofluorescentie microscopie. De ontwikkeling van technieken voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes ingeschakeld een nauwkeuriger onderzoek van de inhoud van de phagosome in termen van endosome en lysosoom markers. Tot op heden, de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes is de subcellular fractionering op sacharose stap verlopen^18,20. Deze methode vereist echter meerdere centrifugeren stappen die kunnen leiden tot mechanische schade aan phagosomes, kunnen invloed hebben op de stabiliteit van de phagosomal componenten (eiwitten en lipiden) en tijdrovend is. Bovendien, het vereist het gebruik van een ultracentrifuge: een stuk van gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk zijn voor elke laboratorium.

Onlangs, een nieuwe aanpak is toegepast op de isolatie van bacteriële-bevattende phagosomes, waarin de bacteriële pathogenen worden aangeduid met biotinyleerd lipopetide (Lipobiotin) en later geëxtraheerd met behulp van streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen²¹ . Wij stellen een alternatieve complementaire methode door het labelen van bacteriële oppervlakte amine-bevattende macromoleculen met NHS-Biotine gevolgd door daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen zijn hoogverrijkt in endosome en lysosoom markers en kunnen worden gebruikt voor een breed scala van tests, uit eiwit analyse omics analyse. Bovendien, vereist het geen gespecialiseerde apparatuur zoals ultracentrifuges. Bovendien, door het elimineren van de stappen van centrifugeren, zowel de mechanische schade aan phagosomes en de hoeveelheid tijd werkzaam zijn aanzienlijk kleiner zijn. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de isolatie van de phagosomes met andere bacteriën, zoals de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, ook opgenomen in dit manuscript. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is een eenvoudige, kosteneffectieve, en minder tijdrovend dan het klassieke isolement door sacharose verrijkt verloop-ultracentrifugatie, waardoor zeer phagosomes bacteriën bevatten.