天然铀对体外破影响的分析方法
概要
众所周知, 铀会影响骨骼的新陈代谢。在这里, 我们提出了一项协议, 目的是研究天然铀暴露对破骨细胞的活性、分化和功能的影响, 这是负责骨质吸收的单元。
Abstract
铀已经被证明会干扰骨骼生理学, 并且它是公认的, 这种金属在骨骼中积累。然而, 对于天然铀对骨细胞行为的影响却知之甚少。特别是, 铀对破骨细胞的影响, 即负责骨质基质的吸收, 没有记录在案。为了研究这个问题, 我们已经建立了一个新的协议, 使用铀乙酸作为天然铀的来源和小鼠的原始264.7 细胞系作为破骨前体的模型。在这里, 我们详细介绍了测试铀对破骨细胞的毒性作用所需的所有化验结果, 并评估其对破的影响, 以及成熟破骨的吸收功能。我们所开发的条件, 特别是用于制备含铀的培养基和原始264.7 细胞的播种, 可以获得可靠和高度的生殖结果。此外, 我们还优化了使用软件工具, 以方便分析各种参数, 如破骨细胞的大小或吸收矩阵的百分比。
Introduction
铀是一种天然存在于土壤、空气和水中的放射性元素;因此, 动物和人类在他们的饮食中接触到天然铀。除天然来源外, 铀来源于人为活动, 增加了其在环境中的丰度。铀造成化学和放射性危害。然而, 由于天然铀 (这是一种含有 99.27% 238u、0.72% 235u 和 0.006% 234u) 的同位素混合物, 具有低特定活动 (25.10 3. g-1), 其对健康的影响归因于其化学毒性。
无论其进入途径 (吸入、摄食或皮肤暴露), 大多数进入人体的铀都是用粪便清除的, 只有一小部分到达全身循环。大约67% 的铀在血液中依次被肾脏过滤, 并在 24 h1内将身体留在尿液中。其余部分大多沉积在肾脏和骨骼中, 两个主要靶器官的铀毒性2,3,4。由于骨架已被确定为铀长期保留期的主要站点2,3,4,5,6, 已进行了几项研究, 以探索铀对骨生理的影响7。
骨是一种矿化组织, 在其一生中不断被重塑。骨重塑是一个复杂的过程, 依赖于专门的细胞类型和主要包括两个阶段: 前已存在的旧基质的骨吸收, 然后再由成骨细胞构建。破骨细胞是由造血原细胞融合而成的大型多干细胞, 移植到它们附着在骨8的吸收部位。他们的附件同时发生与他们的细胞骨架的广泛的整顿9。这种重组需要建立在细胞和骨表面之间的隔离隔间, 其中的破骨体分泌质子, 导致羟基磷灰石的溶解, 以及参与降解的蛋白酶有机基质。由此产生的降解产物是 endocytosed 的, 通过细胞传送到与骨表面相对的膜区并分泌, 这一过程称为 transcytosis10,11。
结果从体内和体外研究表明, 铀抑制骨形成和改变成骨细胞的数量和活性7,12。相比之下, 铀对骨质吸收和破骨细胞的影响却没有得到很好的探索。几个体内研究报告了铀硝酸对小鼠或大鼠的骨吸收的增强作用13,14。此外, 一项流行病学调查表明, 通过饮水增加的铀摄入量往往与男子15的骨吸收标记物的血清水平增加有关。综上所述, 这些结果导致了这样的结论: 铀积累在骨骼中可以促进骨吸收。然而, 涉及铀的这种潜在作用的细胞机制仍然是一个有待商榷的问题。因此, 我们决定研究铀对吸收骨细胞行为的影响。
在这里, 我们描述的协议, 我们已经建立的特点和量化的影响, 天然铀的前破骨细胞的生存能力和破骨细胞分化和吸收活动。本文所述的实验已经完成了原始的264.7 小鼠转化巨噬细胞系, 这可以很容易地区分成骨细胞时, 培养在存在的因子 RANKL 4 或5天, 这是经典的研究破骨细胞分化与功能16。所开发的程序是可靠的, 给予高度重现性的结果, 完全适用于原发性破骨细胞。基于所有这些原因, 我们认为这种方法有助于更好地了解骨中铀毒性所涉及的分子机制。此外, 我们认为, 这一方法可作为筛选新的铀螯合剂的工具加以调整。
Protocol
Representative Results
Discussion
据我们所知, 这是第一次详细的程序, 目的是研究天然铀对骨吸收细胞的影响。这种方法将有助于更好地了解铀对骨骼生理的影响, 并可能为铀合剂的筛选提供一个有趣的新工具。此外, 我们认为, 此处所述的议定书可用于研究其他重金属对 osteoclatogenesis 的影响。
众所周知, 铀在培养基中与无机和有机成分复合,18,19,<sup class="xr…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢尚塔尔 cro 的技术援助。
这项研究的经费来自 “科特布斯 Atomique 和辅助能源替代品” (URANOs-方案横向 de Toxicologie 杜-cea 和 CPRR cea-阿海珐), 以及来自国际抵抗力量 (铀的毒性: 矿的多级方法过程中的骨骼, ANR-16-CE34-0003)。这项工作也得到了尼斯大教堂-安蒂波利斯和 CNRS 大学的支持。
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
参考文献
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