Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula
概要
Este protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma variaciones número de copia de plantas.
Abstract
Mutantes son recursos genéticos inestimable para estudios de la función génica. Para generar colecciones mutantes, pueden utilizarse tres tipos de mutágenos, incluyendo biológicos como el T-ADN o transposon, químicas como Metanosulfonato de etilo (EMS) o físicos como la radiación de ionización. El tipo de mutación observada varía dependiendo el mutágeno utilizado. Para mutantes inducidos por la radiación de ionización, mutaciones incluyen la deleción, duplicación o cambio. Mientras que el T-DNA o la mutagénesis de transposon se limita a especies que son susceptibles de transformación, mutagénesis química o física puede aplicarse a una amplia gama de especies. Sin embargo, la caracterización de las mutaciones derivadas de mutagénesis química o física tradicionalmente se basa en un enfoque clonación basada en mapas, que es el trabajo intensivo y consume mucho tiempo. Aquí, mostramos que una plataforma de Hibridación Genómica Comparativa (aCGH, en inglés) en arreglos de discos de alta densidad del genoma puede ser aplicada para eficientemente detectar y caracterizar variaciones número de copia (CNVs) en mutantes derivados de mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en Medicago truncatula, una especie de leguminosa. Análisis de la secuencia de genoma muestra que hay más de 50.000 genes o genes modelos en M. truncatula. En el presente, inducida por la FNB mutantes de M. truncatula se derivan más de 150.000 líneas de M1, que representan recursos genéticos inestimable para estudios funcionales de los genes en el genoma. La plataforma de la aCGH, en inglés que se describe aquí es una eficaz herramienta para la caracterización de mutantes de FNB-inducida en M. truncatula.
Introduction
Leguminosas (Fabaceae) son la tercera familia de plantas con flores, con muchas especies económicamente importantes como la soja (Glycine max) y alfalfa (Medicago sativa). Las plantas leguminosas pueden interactuar con bacterias del suelo fijadoras de nitrógeno, generalmente llamado Rhizobium para desarrollar nódulos de la raíz en que dinitrogen atmosférico es reducido a amoníaco para uso por la planta huésped. Como tal, cultivos de leguminosas requiere pocas aportaciones de fertilizantes nitrogenados y así contribuyen a la agricultura sostenible. Cultivos de leguminosas producen hojas y las semillas con alto contenido de proteína, que sirve como excelente forraje y cereales. Sin embargo, especies de leguminosas cultivadas generalmente tienen estructuras de genoma complejo, haciendo estudios funcionales de genes que desempeñan un papel clave en procesos específicos de leguminosas engorrosos. Medicago truncatula ha sido adoptado ampliamente como una especie de modelo para estudios de leguminosas principalmente porque (1) tiene un genoma diploide con un tamaño de genoma haploide relativamente pequeña (~ 550 Mbp); (2) las plantas pueden transformar estable para estudios funcionales del gene; y (3) se está estrechamente relacionado con alfalfa (M. sativa), la reina de las forrajeras y muchos otros cultivos económicamente importantes para los estudios traslacionales. Recientemente, la secuenciación del genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 ha sido lanzado1,2. Anotación del genoma muestra que hay más de 50.000 genes predichos o modelos de gene en el genoma. Para determinar la función de la mayoría de los genes en M. truncatula genoma es una tarea difícil. Para facilitar los estudios funcionales de genes, se ha generado una amplia colección de mutantes en la gama de más de 150.000 líneas de1 M utilizando mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrón rápido, un mutágeno de ionización de alta energía, se ha utilizado en la generación de mutantes en muchas especies de plantas como Arabidopsis5,6,7de arroz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, cebada (Hordeum vulgare) y Lotus japonicus10. Una gran parte de las mutaciones derivadas de mutagénesis FNB son debido a supresiones de ADN varían en tamaño desde unos pocos pares de bases a mega pares9,11. Muchos genes fenotipo asociado han sido correctamente identificados y caracterizados de4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, reproducción molecular de los genes subyacentes de mutantes FNB dependía de un enfoque basado en el mapa, que es lento y limita el número de mutantes caracterizados a nivel molecular. Recientemente, varios enfoques gratuito incluyendo métodos basados en la transcripción, genoma alicatados hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos para la detección de variación número de copia de ADN y la secuenciación del genoma entero, ha sido empleado para facilitar la caracterización de mutantes de deleción en diversos organismos, incluyendo animales y plantas20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Para facilitar la caracterización de mutantes de la FNB en M. truncatula, un genoma completo basado en el arreglo hibridación genomic comparativo (CGH) plataforma ha sido desarrollada y validado. Como se informó en los sistemas animales, el array-CGH plataforma permite la detección de variaciones de número de copia (CNVs) en el nivel de todo el genoma en mutantes de M. truncatula FNB. Además, las lesiones se pueden confirmar por PCR y fronteras de eliminación pueden ser identificadas por la secuencia. En general, la plataforma CGH array es una herramienta eficiente y eficaz en la identificación de lesiones en mutantes de M. truncatula FNB. Aquí, se ilustran el procedimiento CGH array y PCR caracterización de las fronteras de la canceladura en un mutante de M. truncatula FNB.
El siguiente protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma de número de copia variaciones en las plantas. Por ejemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante se utilizó para identificar regiones de eliminación y genes candidatos asociados con fenotipos mutantes. Mutante de M. truncatula FN6191, aislado originalmente de un neutrón rápido supresión inducida por el bombardeo mutante colección32 (véase Tabla de materiales), exhibió un fenotipo hiper-nodulación después de la inoculación con el suelo bacteria, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , en contraste con las plantas de tipo silvestre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado una plataforma CGH en arreglos de discos para la detección y caracterización de bombardeo del neutrón rápido (FNB)-inducida por mutantes de M. truncatula CV Jemalong A17. Para demostrar el uso de la matriz método CGH en la detección de mutaciones en el gen, se realizó análisis de aCGH del mutante FN6191, que exhibieron un fenotipo hiper-nodulación en contraste con las plantas de tipo silvestre, cuando se inoculó con S. meliloti Sm1021. Para el análisis de segmentación, un …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación de este trabajo se proporciona en parte por una subvención de NSF planta Genome Research (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
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