يصف لنا طريقة لموقع يسترشد ستيريوتاكتيكالي والتعرض، والاجتثاث من القشرة السمعية في الفئران. يتم تقييم إضفاء الطابع المحلي على الاجتثاث استخدام خريطة تنسيق تشريح الجثة.
تزداد شعبية بين علم الأعصاب السمعية المحققين الذين يرغبون في الاعتماد على خبرة اللدونة والعمليات الإدراكية السمعية القشرية تحكم الصوت المعالجة في الأنوية سمعي subcortical القشرة السمعية الفئران (AC). معالجة جديدة للتحديات، إجراء لتحديد بدقة وجراحيا القشرة السمعية فضح سيعجل هذا الجهد البحثي. جراحة المناظير باستخدام الأشعة يستخدم بشكل روتيني في البحوث السريرية قبل في نماذج حيوانية انجرافت إبرة أو قطب كهربائي في مكان محدد مسبقاً داخل القشرة السمعية. في بروتوكول التالية، ونستخدم أساليب المناظير باستخدام الأشعة بطريقة مبتكرة. نحن تحديد أربع نقاط تنسيق فوق سطح temporal bone الفئران لتحديد إطار الذي، بمجرد فتح، يكشف بدقة على حد سواء الأولية (A1) والثانوي كورتيسيس (الظهرية والبطني) يتراوح استخدام هذا الأسلوب، ونحن ثم قم العمليات الجراحية الاجتثاث AC. بعد أن يتم تنفيذ مثل هذا تلاعب، من الضروري تقييم التعريب، والحجم، وملحق للآفات في القشرة. وهكذا، نحن أيضا وصف أسلوب لتحديد بسهولة بعد الوفاة الاجتثاث AC استخدام خريطة تنسيق شيدت بنقل حدود سيتوارتشيتيكتورال AC إلى سطح الدماغ. المزيج من موقع يسترشد ستيريوتاكتيكالي والاجتثاث من التيار المتردد مع إضفاء الطابع المحلي على المنطقة المتضررة في تشريح الجثة خريطة تنسيق يسهل التحقق المعلومات التي تم الحصول عليها من الحيوان، ويؤدي إلى إجراء تحليل أفضل و فهم البيانات.
الفأر واحد من النماذج الحيوانية الأكثر استخداماً في علم الأعصاب السمعية. متانة سلوكها يجعلها قادرة على العمل لمئات تجارب في اليوم الواحد. حساسية والبراعة الطيفية لاستماع1،2، وتنظيم التشريحية والوظيفية لنظامها المركزي، مماثلة ل الثدييات الأخرى3، جعل الفئران نموذجا حيوان مناسبة لتحليل طائفة واسعة من مواضيع البحث في علم الأعصاب السمعية. القشرة السمعية الفئران (AC)، على وجه الخصوص، كانت موضوع العديد من الدراسات التشريحية والفسيولوجية التي حاولت فهم هيكلها والمنظمة، ودور في معالجة الصوت3. في الوقت الحاضر، أصبح التيار المتردد شعبية كبيرة بين علماء الأعصاب المهتمة في اللدونة الاعتماد على الخبرة والإدراك السمعي، وأساس تنظيم الحقل تقبلا متشابك ومراقبة القشرية لمعالجة الصوت في سوبكورتيكال السمعية الأنوية4،5،،من67،،من89. للتصدي للتحديات التي تطرحها هذه النهج الجديدة، والإجراءات التي يمكن تحديد بدقة وفضح جراحيا AC ستعجل الجهود البحثية. تقنيات المناظير باستخدام الأشعة تجعل من السهل لتعريب مناطق محددة داخل المخ دون اختبار فسيولوجيا. على الرغم من أن حجم الدماغ يختلف قليلاً بين الحيوانات، يمكن تحديد موقع أي منطقة الدماغ استخدام المناظير باستخدام الأشعة إحداثيات مجموعة من المعالم على جمجمة الدماغ الفئران.
الاجتثاث مقيد من AC هو الاستئصال الجراحي للمنطقة الحسية من قشرة الأوثق صلة بالسمع. وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لحظر نشاط التيار المتردد، مثل التبريد أو المحلية ليدوكائين حقن10،11،12، الاستئصال الجراحي نتائج ميلان خسائر مزمنة في الدالة. وهكذا، أبلاتيونس AC أكثر ملاءمة لدراسة آثار الحرمان القشرية في الأجل الطويل، وكذلك ظواهر اللدونة الآفة اللاحقة. مزيج أساليب المناظير باستخدام الأشعة مع أبلاتيونس الجراحية للتيار المتردد استخدمت بنجاح في دراسة الآثار الفسيولوجية والسلوكية والجزيئية لمراقبة القشرية الحرمان13،14،15 ،،من1617،،من1819. على سبيل المثال، نموذج الفئران مع الثنائية التيار المتردد أبلاتيونس قد استخدمت لدراسة آثار الاجتثاث القشرية في منعكس جفل السمع والدماغ السمعية الردود (ABR)16. في الآونة الأخيرة، وقد قارنا آثار تلك الأحادية مقابل أبلاتيونس الثنائي لإنتاج الفئران التيار المتردد في عتبات ABR والاتساع، والاختفاء في نقاط زمنية مختلفة بعد إصابة18. وبالإضافة إلى ذلك، أيضا يستخدم نموذج الفئران التقييدية AC الاجتثاث لدراسة تأثير كورتيكوفوجال مسار الانحطاط في ال14،13،كولكس أدنى15 و الإذن الداخلية17 ،19. بعد أن يتم تنفيذ مثل هذا تلاعب في الدماغ، من الضروري تقييم التعريب، والحجم، وملحق للآفات في القشرة. على الرغم من المفيد جداً، هي القيد الرئيسي لخرائط تونوتوبيك استناداً إلى استجابات الخلايا العصبية،من2021 التقنيات الكهربية المطلوبة لتحديد موقع حقول السمعية في الدماغ الفئران. إذ قد لا جميع المختبرات بالمعدات اللازمة و/أو الخبرة اللازمة لإجراء مثل هذه التسجيلات، ونحن شيدت خريطة تنسيق استناداً إلى نقل حدود سيتوارتشيتيكتورال AC إلى صورة ل سطح الدماغ18. هذه الخريطة يمكن أن تكون مفيدة جداً لتحديد موقع التيار المتردد دون اختبار فسيولوجيا.
هذا البروتوكول وصف أسلوب لموقع ستيريوتاكتيكالي الإرشادية والتعرض الجراحية، والاجتثاث من لجنة التدقيق في الفئران. كما يصف كيفية استخدام لدينا خريطة تنسيق18 لتعريب تمديد الآفة بسهولة على صورة لسطح العقول أبلاتيد.
عملية جراحية في الدماغ ناجح يتوقف على عاملين هما: حفظ الحيوان على قيد الحياة أثناء وبعد الإجراء، ودقة تحديد مجال الاهتمام. ضمان أن الفئران هو عميق تخديره أثناء الجراحة (اختبار رد الفعل الانسحاب)، وتتلقى المسكنات كافية وينبغي أن يساعد المضادات الحيوية غير السامة البقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تظل الفئران على وسادة تدفئة حتى أنه يستيقظ من التخدير لتفادي انخفاض درجة حرارة الجسم. خياطة ستنخفض قابلية للإصابة، والأسلوب السليم أمر حيوي: سوف تختار الحيوانات في تلك القصاصات الجرح، حيث ينبغي أن يكون مزروع ضيق ما يكفي لمنع إزالة دون وضع الكثير من التوتر على الجرح.
لتحديد بدقة التيار المتردد (أو أي مجال آخر من مجالات القشرية)، من المهم تحديد موقف بريجما وامدا 0 إينتيراورال لاستخدامها كمراجع لحساب حدود المنطقة المستهدفة. سيؤدي إلى أي خطأ في حساب الإحداثيات الاستئصال الجزئي للتيار المتردد أو التطلع غير مرغوب فيها من غيرها من المناطق المحيطة بها. وهكذا، نصيحة إبرة ينبغي فقط لمس العظام في 0 إينتيراورال، وثم ترجمة إحداثيات أنتيرو الخلفي والجانبي ميديو وفقا لما تم وصفه في هذا البروتوكول.
في هذه المخطوطة، نحن أيضا وصف كيفية كشف جراحيا ويجتذ AC. هناك ثلاث خطوات حاسمة: عملية الحفر، وافتتاح وإزالة في السحايا، والاجتثاث من الطموح. ينبغي إجراء الحفر بسرعة منخفضة مع ضغط الحد الأدنى، كما يولد بسرعة حفر عالية الحرارة التي يمكن أن تؤثر على القريبة الهياكل سوبكورتيكال. ومع ذلك، الحفاظ على سرعة منخفضة وتبريد منطقة الحفر مع المحلول الملحي المعقم الباردة ينبغي منع أي ضرر. وباﻹضافة إلى ذلك، ضغط الحد الأدنى أمر أساسي لتجنب كسر مفاجئ للجمجمة والإصابة اللاحقة للقشرة الكامنة. ينبغي أن يجري فتح وإزالة السحايا التي تغطي لجنة التدقيق بعناية لتجنب فصل الأوعية الدموية. في حالة حدوث نزيف، التشخيص المبكر والمتأخر غير المواتية عموما ومن المشكوك فيه ما إذا كان مثل هذا حيوان يفي بمعايير إدراج دراسة موثوق بها. ونحن نوصي القتل الرحيم في هذه الحالة. أخيرا، يجب أن التطلع (ربما أكثر الجوانب صعوبة في أداء آفة فعالة)، تقتصر على الرمادية. هناك اثنين من المؤشرات التي يمكن أن تساعد في الكشف عن وجود هذه المسألة الأبيض: (1) إجراء تغيير في تباين الألوان, كهذه المسألة الأبيض أكثر إشراقا من المادة الرمادية؛ (2)، ووقف نزيف من الشرايين تثقيب.
بعد تنفيذ أي تلاعب في الدماغ، من الضروري تقييم التعريب، والحجم، وتمديد هذا الإجراء في القشرة لتحليلها لاحقاً والتحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها من الحيوان. في هذه المخطوطة، نحن بالتفصيل كيفية تعريب الاجتثاث أداؤها في القشرة استخدام خريطة تنسيق الموصوفة سابقا لدينا مجموعة18. شيد هذه الخريطة باستخدام مراجع التشريحية التي تم الحصول عليها من عمليات إعادة البناء المسلسل قسم من أقسام النسيجي، ارتباطاً بأطلس الدماغ الفئران22أوضح وواطسون. وبناء على ذلك، الخريطة يفرق بين (A1) الابتدائية والثانوية كورتيسيس (الظهرية والبطني) من لجنة التدقيق. والميزة الرئيسية لهذه الخريطة تنسيق أنه يتيح التعريب السريع للآفة بفرض صورة مأخوذة من السطح جانبية من الدماغ توضع في مصفوفة الدماغ السهمي. ميزة أخرى أن استخدام مختبرات مع خبرة أقل في تشريح الخريطة طريق تكييفه على نماذج حيوانية. أنها فقط اللازمة ضبط المسافات بين بريجما، لامدا، ومراجع 0 إينتيراورال في دماغ تحكم perfused، ومقياس الخريطة صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك. استخدام “الشق رهينال” كمرجع لضبط الصورة للدماغ للخريطة. لا يمكن تحديد عمق الاجتثاث في هذه الخريطة تنسيق، ولذلك فإنه ينبغي أن تحدد في أقسام نسيجية في الدماغ.
هي مزيج أساليب المناظير باستخدام الأشعة مع التعرض الجراحية للتيار المتردد الطرق الأساسية التي يمكن تطويعها بسهولة أي المحقق الذي يرغب في استهداف AC في الفئران. قد يكون هذا لتجربة حادة أو يتطلب غرس الأجهزة الدائمة. وعلاوة على ذلك، الاستئصال الجراحي للتيار المتردد سبق استخدمت كنموذج لدراسة آثار الحرمان المزمن القشرية في جلسة الاستماع. يمكن أيضا استخدام أبلاتيونس التيار المتردد لدراسة آثار الانفرادية AC أبلاتيونس تمارس في سائر المناطق القشرية، أو بمثابة نموذج للسكتة الدماغية. وهكذا، تصاميم تجريبية الموصوفة هنا هي الأساليب المفيدة التي يمكن تطبيقها بصورة فردية أو في مجموعة إلى مجموعة واسعة من تصاميم تجريبية.
The authors have nothing to disclose.
كان يؤيد هذا البحث بمنحه مقدمة من وزارة الاقتصاد و “القدرة التنافسية” (مينيكو) من “حكومة إسبانيا”، SAF2016-78898-C2-2-ر.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |