Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

1. hasat in bitki maddi hasat taze bitki materyali (~ 20 mg) ve % 96’sı (v/v) etanol daldırın ve hemen 30 dk 70 ° C’de kuluçkaya; Bu enzimler mevcut aşağılayıcı herhangi bir hücre duvarı devre dışı bırakır. Kuru malzeme için başlamak vasıl adım 2. Dikkat: Etanol yanıcı. Not: Tek bir kök veya rozet yaprak analiz için yeterli malzeme sağlar. Ancak, daha büyük bir miktar doku havuza alınmış ve bu tartmak ve işlemek daha kolay olduğu analiz daha az sayıda hataları ortaya. Dikkatle doku türünü kaydedin ve gelişimsel sahne, polisakkarit yapısı olarak her ikisi ile değişir. Örneğin, Arabidopsis thaliana ile (kullanılan burada), doku Boyes vd metotlarından göre sahne 15 Not: Bu protokol için biz nerede ilk silique tam olarak değil ama sararma elongated önümüzdeki kök alt yarısını kullandık. 2. hazırlık, alkol çözünmez kalıntı (Hava) hazırla hava, tabi belgili tanımlık yöntem Mortimer vd. 9 veya çözünür şekerler, sukroz ve nişasta gibi eksik bir toz üretmek için başka bir benzer yöntem. 3. Aliquoting ve hava ön arıtma Not: tam olarak her örnek malzeme ilgi polisakkarit ve (b) tarafından yayımlanan oligosakkaritler ortalama boyutu (a) ve bereket üzerine bağlıdır için gerekli hava miktarı GH. Deneme duyarlılığını oligosakkaritler belirler yani yöntemi tek bir floresan molekül her oligosakkarit azalan bakiyeli sonuna ekler. GH11 ile sindirilmiş Arabidopsis kök içinde xylan için 100 µg Mortimer olduğu gibi tavsiye edilir, ancak bir kılavuz olarak, glucomannan Arabidopsis kök (açıklandığı gibi) GH5/GH26 ile sindirmek için 500 µg 11, tavsiye edilir ' s çalışma 3. 15 mL santrifüj tüpüne hava (10-15 mg) tartmak ve H 2 O 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hatta bir süspansiyon ulaşmak için girdap. Bu sorunlu ise, o zaman bu işlem yardımcı olmak için bir cam homogenizer kullanın. Aliquot 500 µg microfuge içine tüpler. Kuru vakum santrifüj kullanarak aliquots (Tablo reçetesi görmek) gecede 30 ° c Öncesi tedavi Hava 1 M NaOH ile (20 µL) oda sıcaklığında; 1 h için bu polisakkaritler de-acetylates ve biyokütle yapısını bozmakta ve GH erişim sağlayan selüloz microfibrils şişer. Not: Bu adım-ebilmek var olmak Kaptan için saflaştırılmış polisakkaritler. DİKKAT – güçlü asit/baz. Bir aliquot için bir Hayır-enzim hava kontrol dahil (aynı adım 4.1 hariç tüm örnekleri işlenir. söz konusu değildir). 200 eklemek µL H 2 O ve 20 µL 1 M HCl nötralize etmek için. PH 1 µL çıkarıp kağıt pH göstergesi şeritler lekelenme ~ 6-7 arasındadır testi. Ekle 50 µL 1 M amonyum asetat arabellek, pH 6.0 (veya hangisi pH çalışmada kullanılan GHs için uygundur) ve toplam hacmi 500 µL vermek H 2 O. Not: Amonyum asetat kurutma üzerine sublimes bu yana ve bu örnek için ek tuz eklemek değil bu yüzden kullanılır. Aşırı tuz PACE jel üzerinde yoksul grubu-şekli ve çözünürlük yol açabilir. 4. Hidroliz ile glikosil Hidrolazlar (GHs) hava Not: tartışmaya belirtildiği gibi GHs Saflık önemlidir. Tek kullanım, heterologously ifade benzeşme enzimler saf. Üreticinin her yerinden aldıktan sonra bir gecede GH miktarda artan substrat (Örneğin, 500 µg hava) tanımlanmış aliquots hidrolize (Örneğin, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 adet/µL). GH aşırı zaman PACE parmak izi özdeş arayacaktır. Enzim aşırı hidroliz reaksiyonu bitiş noktası yaklaşıyor emin olmalıyız çünkü bir tekrarlanabilir sonuçlar elde gereklidir. Ekle bir önceden belirlenmiş miktar (yukarı bakın) mannanases (GH5 ve GH26 11) hava aliquots arabelleği için adım 3.5, aynı zamanda olumlu bir denetim (konjac glucomannan 30 µg) ve bir no-hava negatif kontrol (enzim karışımı bir boş tüp). Girdap ve kısa bir süre tepki karışım tüp alt toplamak için sonra döndür. Kuluçkaya gecede 37 ° C (ya da seçim GH için uygun sıcaklık) nazik ajitasyon (~ 100 rpm). 20 dakika süreyle 95 ° C’de kuluçka tarafından tepki durdurmak Not: Cap kilitler kaldırılarak açılan microfuge tüpler mühürlemek için kullanılabilir. Bir tezgah üst microfuge maksimum hızda 10 dakikadır kullanarak santrifüj kapasitesi ve süpernatant korumak. Resuspend Pelet 250 µL H 2 O, yukarıdaki gibi santrifüj ve süpernatant korumak. Her iki supernatants birleştirmek ve bir vakum santrifüje kuru (Tablo reçetesi görmek) 30 ° c (~ 3 h ya da gece Isıtma olmadan). 5. Oligosakkarit standartların hazırlanması hazırla 1 mM hisse senedi çözümleri H 2 O mannoz (adam), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (adam 5) ve mannohexaose (adam 6), tüm β, 1-4 bağlantılı. Aliquot ve mağaza-20 ° c kadar gerekli. Bir adam 3 farklı konsantrasyonlarda 1 µL (Standart S1), 2 µL (S2) birleştirerek 1-6 karışım hazırlamak veya tüm altı 5 µL (S3). Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C’de (~ 1 h). 6. Oligosakkaritler Derivitization hazırla 0.2 M karıncalar (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic asit) H 2 O hisse senedi bir çözüm: Asetik asit 17:3. Katı tamamen erimesi için 60 ° c sıcak hisse senedi. Mağaza için 2-3 ay ışığı, korumalı-20 ° C’de. 2-picoline borane (2-PB) DMSO 0.2 M stok çözeltisi hazırlamak. Bu son derece higroskopik, öyle hemen DMSO içinde aldıktan sonra tüm toz resuspend. Aliquot ve mağaza-20 ° c 1-2 yıldır. Gerekli (2 hafta ve o zaman silmek için 4 ° C’de deposu) olarak aliquots çözülme. H 2 O derivatization arabellek hazırlamak: Asetik asit: DMSO 17:3:20. Karıncalar, 2-PB ve 10 µL derivatization arabelleği 5 µL 5 µL eklemek, her örnek için . Kısaca tüp alt toplamak için Döndür girdap iyice ve sonra kısa bir süre tekrar döndürün. Reaksiyon açıklaması için bkz: şekil 1. Incubate örnekleri gecede ışıktan korunan 37 ° C’de. Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C’de (~ 2 h). Resuspend örnekleri ve standart 100 µL 3 M üre. Gerekli kadar ışıktan korunan-20 ° C’de mağaza. 7. PACE hazırlanması jelleri Not: jel döküm donanımları Meclisi marka bağlı olacaktır. Burada, biz use bir Dikey Elektroforez Sistemi (bakınız Tablo malzemeler), donanımlı 18 cm x 24 cm cam plakanın ve 1.5 mm boşluk ekleyiciler. Jel döküm donanımları üretici başına bir araya ' s yönergeleri. Olun 10 x hızı arabellek (1 M Tris-Bor, pH 8.2) aşağıdaki gibi: 121.14 g Tris-baz ~ 400 mL H 2 O ve çözülmeye karışımı ekleyin. PH 8.2 için buna ek olarak katı Borik asit (yaklaşık 60 g) tarafından ayarlamak ve 1 birim görünmesini sağlamak L. % 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) hisse senedi H 2 içinde O. Aliquot olun ve saklamak-20 ° c tezcan aliquots bir kez, mağaza 4 ° C’de ve 2 hafta sonra atın. Olun ve çözme jel dökmek. Yukarıdaki donatımı 1 jel 50 mL eşit. 50 mL santrifüj tüpü H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x hızı arabellek, 24.6 mL % 40 Akrilamid/Bis-Akrilamid (29:1 acrylamide:Bis) karıştırın. (Uyarı: toksik). 200 µL APS ve 20 µL N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) ekleyin. (Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek için) karışımı yavaşça tersine çevirin. Dökmek bir serolojik kullanarak jel veya ~ 4 cm cam plakanın üst altındaki diğer büyük hacimli pipet. Hava kabarcıkları jel içinde kapana olasılığı dikkat edin. Onlar yapmak, dökme durdurmak ve tilt/onları serbest bırakmak için jel dokunun eğer. İsopropanol (dikkat : yanıcı) ile ya da dikkatle, H 2 (20-30 dakika) polimerize, sonra üst tabaka dökmek için O. izin ver jel ile jel kaplama. İsopropanol kullandıysanız, 2 x H 2 O. kuru ile Bloting kağıt kullanarak herhangi bir aşırı sıvı yıkayın. Yapmak ve yığın jel dökmek. Mix 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x hızı arabellek, 2,8 mL Akrilamid/Bis-Akrilamid (dikkat: zehirli), 80 µL APS ve TEMED 8 µL 15 mL santrifüj tüpü içinde. Karıştırmak için ters çevir ve üstüne polimerli çözme jel yerleşimi. Yavaşça taraklar, bindirme hava kabarcıkları tarak dişleri altında kaçınarak takın. İzin ver jel (20-30 dk), polimerize şal nemli dokusu ve sonra plastik wrap ve gerekli kadar 4 ° C de saklayın. Tarak yerde mağaza. Not: (daha az 1 hafta ideal olsa da) jeller en fazla 2 hafta için saklanabilir, nemli tutulursa. 8. Bir hızda çalışan jel Yükleme sipariş takip içinde yardımcı olacak, cam üzerinde iyi pozisyonlar etiketlemek için kalıcı bir kalem kullanın ve tarak kaldırılır bir kez nerede teşhis etmek için kuyu vardır. Tarak kaldırın. Kuyuları ile 1 x hızı tampon doldurun. 10 µL microsyringe standartları ve örnekler 2 µL kuyu yüklemek için kullanın. Kötü örnekleri çalıştırmak eğilimindedir en dıştaki şerit kullanmaktan kaçının. Jel çalışan cihaz üst TMMOB montaj ve 1 x hızı arabellek içeren jel bir su tankında soğutmalı (~ 10 ° C) çalışan (10 ° C) yerleştirin. Üst odası ile 1 x hızı tampon doldurun. Güç ve koşmak vasıl 200 V jel (Sabit V) için açın 30 ortaçağ halk ozanı ve artış voltaj 1000 V 1 saat 40 dakika için. Işık (tanklar siyah çöp torbaları sarma tarafından Örneğin,) jeller korumak. Not: jelleri ~ 5 dk voltaj açma ve daha sonra başka bir 5 dakika sonra 1000 V gerilim artan sonra kontrol edin. O zaman büyük olasılıkla bir arabellek sızıntı gerilim korumak güç paketi eğer. Jel tankından kaldırın. Dikkatle tüm contalar yerleşimini kontrol üst odası yeniden monte. Büyük bir çip üst kenarına cam levha şekillendirme conta ile iyi bir mühür plaka engelleyebilir. Bu genellikle geçici olarak üst odası eklemeden önce bir damla % 5 (w/v) erimiş özel cam kırık parçası ekleyerek çözülebilir. 9. PACE jel görselleştirme Not: görüntüleme sistemi uzun dalga UV ampul transilluminator ve fluorophore için burada 530 nm uygun kamera için bir emisyon filtre ile donatılmış bir jel kullanımı. Alternatif olarak, bir lazer tarayıcı da, Goubet 2 ‘ de açıklandığı gibi kullanılabilir. Görüntüleme sistemi jel nemli hav bırakmayan dokusu ile silerek toz ücretsiz olduğundan emin olun. Jel PACE tankından kaldırmak ve jel hala cam levhalar yaylıdır iken kısaca görüntüleyin (< 80 ms) boya açık hala üzerinde jel olup olmadığını belirlemek için. Jel bir kama aracını kullanarak açın ve jel hala bir cam levha üzerinde iken, bir pizza kesici her iki yığın jel kaldırmak için kullanın ve boya açık hala jel, jel dibinde ise. ~ 5 mL H 2 O transilluminator yüzeyine koymak ve sonra jel transilluminator doğrudan üzerine aktarın. UV 605 için filtre ayarlamak ve görevindeydiler UV transilluminator açın (bkz. Tablo reçetesi) yazılımını kullanarak. Not: Burada kullanılan KARINCALAR fluorophore uyarma/salma, 353/520 vardır nm. Çeşitli pozlama zamanlarda birkaç görüntü almak (Örneğin, 100 ms 10 s). UV ışık Floresans düşürmesini önlemek için (devre dışı bırakmak) UV ışık düğmesini tıklatarak görüntü arasında kapalı olduğundan emin olun. En az 2 görüntüleri yok doymuş bantları (jel görüntüleme yazılımı bu belirtmek) olduğundan emin olun. Yüksek resolution.tif görüntü olarak dosyaları kaydet. Not: Resim görüntüleme sistemi jel ile veya ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gibi serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı kullanarak sağlanan yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Nefelometri tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın.