Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores
概要
Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.
Abstract
Gabaérgica interneurônios corticais são uma população heterogênea de células que desempenham um papel crítico em regular a saída de excitatórios neurônios piramidais, bem como sincronizar as saídas dos conjuntos de neurônio piramidal. Déficits na função interneurônio têm sido implicados em uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e epilepsia. A derivação de interneurônios corticais de células-tronco embrionárias não só permite o estudo de seu desenvolvimento e função, mas fornece insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese de distúrbios relacionados com interneurônio corticais. Interneurônios também tem a notável capacidade de sobreviver, migrar e integrar acolhimento circuitos corticais pós-transplante, tornando-os candidatos ideais para uso em terapias baseadas em células. Aqui, apresentamos um escalável, altamente eficiente e modificado do embryoid corpo-a-monocamada método para a determinação dos progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Usando uma linha de mESC de repórter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolado através de fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Nós também fornecemos métodos para enriquecer para parvalbumin (PV) ou somatostatina subgrupos de interneurônio (SST), que pode ser útil para estudar os aspectos de determinação de destino ou para uso em aplicações terapêuticas que se beneficiariam de interneurônio subgrupo enriquecido transplantes.
Introduction
Em ambos os ratos e os seres humanos, aproximadamente metade dos interneurônios inibitórios tudo corticais (Cristo) se originam dentro de uma estrutura subcortical transitória, conhecida como a medial Eminência ganglionar (MGE), onde os progenitores neuroepithelial de cinsa e outros neuronal e glial subgrupos expressam o fator de transcrição Nkx2.11,2. Subgrupos de CIn ou subtipos são definidos pela interseção morfológica, neuroquímica, eletrofisiológicos e conectividade características3,4. O MGE-derivado de Cristo pode ser agrupados em subgrupos principalmente não-sobreposição com base em sua expressão de PV ou de SST, a expressão da qual correlaciona-se com particular eletrofisiológicos e conectividade tendências5. Disfunção dos interneurônios, especialmente aqueles no subgrupo PV, tem sido implicada em vários neuropsiquiátricas distúrbios e doenças6,7. O objectivo geral deste método é para produzir células-tronco derivadas de progenitores mitóticas e migratórias precursores enriquecidos para PV ou SST CIn destino para estudar Biologia interneurônio cortical e para uso em terapias baseadas em células.
Nós desenvolvemos um método altamente eficiente, escalável para a derivação de progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de mESCs. Usando uma Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dupla repórter mESC linha8, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolados através de FACS e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Ao manipular um número de vias de sinalização, duração da cultura e modo de neurogênese, podemos obter milhões de precursores interneurônio fluorescente etiquetadas apropriados para uma série de aplicações a jusante.
Apesar de vários outros métodos existem para gerar MGE-como progenitores de mESCs9,10,11,12,13,14, nosso método, que depende o Wnt antagonista Antônio-939, é particularmente eficiente na geração de co expressando progenitores tele-encefálico Foxg1/Nkx2.1. Além disso, a capacidade de selecionar para progenitores interneurônio ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando através do nosso sistema de dupla repórter, aumenta muito a capacidade de gerar distintas progenitores e seus descendentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto este método é altamente eficaz na padronização J1-derivado de mESCs (SCRC-1010), nós experimentamos sucesso variável com outras linhas de mESC e isolados clonais. Por exemplo, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivado; Danjo et al 13) responder mal para este protocolo e indução de Foxg1 por DD12 é tipicamente na ordem de 1-2%. Por razões que não entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP outro repórter dual clone (denominado JQ59) foi isolado simultaneamente como a linha descrita n…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Qing Xu para desenvolver a linha de mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP repórter dual, bem como Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros para seus primeiros trabalhos em ajudar a desenvolver este protocolo. Agradecemos também o núcleo de citometria de fluxo CHOP para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).
Materials
| Bottle-top vacuum filter system | Corning | CLS430769 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37 |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Do not filter with base media — add after filtration |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39 |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11 |
| L-glutamine (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11 |
| Tissue culture treated dish (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Non-adherent sterile petri dish (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Leukemia inhibitory factor (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0.1% Gelatin Solution | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11 |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| Smoothened agonist (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated | EMD Millipore | 539624 | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
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