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神経科学

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

概要

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Abstract

Corticali GABAergici sono una popolazione eterogenea di cellule che giocano un ruolo critico in che regolano l’uscita dei neuroni piramidali eccitatori, nonché la sincronizzazione le uscite dell’ensemble neurone piramidale. I deficit nella funzione Interneurone sono stati implicati in una varietà di disordini neuropsichiatrici, compreso la schizofrenia, autismo ed epilessia. La derivazione di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali non solo consente lo studio del loro sviluppo e la funzione, ma fornisce la comprensione nei meccanismi molecolari alla base della patogenesi dei disordini corticali da Interneurone. Interneuroni hanno anche la notevole capacità di sopravvivere, migrare e integrare in host circuiti corticali post-trapianto, che li rende i candidati ideali per l’utilizzo nelle terapie basate sulle cellule. Qui, presentiamo un metodo corpo-a-monostrato embryoid scalabile, altamente efficiente, modificato per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Utilizzando una linea di mESC reporter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Forniamo anche metodi per arricchire per parvalbumina (PV) o somatostatina sottogruppi di Interneurone (SST), che può essere utile per lo studio di aspetti della determinazione di destino o per l’uso in applicazioni terapeutiche che beneficerebbero Interneurone arricchita di sottogruppo trapianti.

Introduction

In entrambi i topi e gli esseri umani, circa la metà di tutto corticale interneuroni inibitori (CIns) hanno origine all’interno di una struttura subcortical transitoria, conosciuta come l’eminenza gangliare mediale (MGE), dove i progenitori di neuroepithelial CIns e altri un neurone e glial sottogruppi esprimono il fattore di trascrizione NKX 2.11,2. Sottogruppi di CIn o sottotipi sono definiti da intersecanti morfologiche, neurochimici, elettrofisiologici e connettività caratteristiche3,4. Il CIns MGE-derivati possono essere raggruppati in sottogruppi per lo più non sovrapposte basati sulla loro espressione di PV o SST, l’espressione di cui correla con particolare elettrofisiologici e connettività di tendenze5. Disfunzione di interneuroni, specialmente quelli nel sottogruppo PV, è stata implicata in più neuropsichiatrici disturbi e malattie6,7. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di produrre cellule staminali derivate mitotici progenitori e precursori migratori arricchiti per destino o PV o CIn SST per studiare biologia Interneurone corticale e per uso in terapie basate sulle cellule.

Abbiamo sviluppato un metodo scalabile, altamente efficiente per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da mESCs. Utilizzando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linea8, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite FACS e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Manipolando un numero di vie di segnalazione, durata della cultura e la modalità della neurogenesi, possiamo ottenere milioni di precursori fluorescente contrassegnati Interneurone adatti per una miriade di applicazioni a valle.

Anche se esistono diversi altri metodi per la generazione di MGE-come progenitori da mESCs9,10,11,12,13,14, il nostro metodo, che si basa su Wnt antagonista XAV-939, è particolarmente efficiente nella generazione Foxg1/NKX 2.1 cheesprimono telencefalici progenitori. Inoltre, la possibilità di selezionare per progenitori Interneurone o loro progenie che esprimono Lhx6 post-mitotici tramite il nostro sistema di dual reporter, migliora notevolmente la capacità di generare distinte dei progenitori e la loro progenie.

Protocol

Nota: La linea di mESC dual reporter descritta in questo protocollo è disponibile su richiesta (sande@mail.med.upenn.edu). 1. Media preparazione Nota: Caldo tutti i media a 37 ° C prima dell’uso nella coltura delle cellule. Media dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) (per la preparazione di 500 mL) Aggiungere 50 mL di siero fetale bovino (FBS) 449 mL di Medium (DMEM dell’Aquila per volta) di Dulbecco e filtro attraverso u…

Representative Results

Il protocollo descritto in questo documento è una versione modificata di nostri protocolli pubblicati15,16,17 ed è stato ottimizzato per l’uso con la nostra linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Aggiungendo l’inibitore di Wnt XAV-939 da DD0-5, combinato con ri-placcatura a DD8, raggiungiamo robusto NKX 2.1 induzione, in cui verso l’alto di 50% di tutti i nuclei DAPI + nella cul…

Discussion

Mentre questo metodo è altamente efficace a patterning mESCs J1-derivato (SCRC-1010), abbiamo sperimentato successo variabile con altre linee di mescita e isolati clonali. Per esempio, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivato; Dergano et al. 13) rispondono male a questo protocollo e Foxg1 induzione da DD12 è tipicamente dell’ordine di 1-2%. Per motivi che non comprendiamo pienamente, clone di Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP un altro reporter dual (chiamato JQ59) che è stato isolato simultaneamente c…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Qing Xu per sviluppare il Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual reporter mESC linea così come Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros per i loro primi lavori su aiutando a sviluppare questo protocollo. Ringraziamo anche il nucleo di cytometry di flusso CHOP per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
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参考文献

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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
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