Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato – encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.
Órgãos em chips, em vitro modelos envolvendo a cultura de tecidos (humanos), dentro de dispositivos microfluídicos, rapidamente são emergentes e promessa de fornecer úteis pesquisa ferramentas para estudar a doença e a saúde humana. Para caracterizar a função de barreira de camadas de células cultivadas dentro dispositivos de órgão-em-microplaqueta, resistência, muitas vezes transendothelial ou transepitelial elétrica (TEER) é medida. Para este fim, eletrodos são geralmente integrados o chip por micromaquinação métodos para fornecer medições mais estáveis do que é alcançado com inserção manual de eletrodos para as entradas do chip. No entanto, esses eletrodos frequentemente dificultam a inspeção visual da camada de célula estudado ou exigem cleanroom caros processos de fabricação. Para superar essas limitações, o dispositivo descrito aqui contém quatro facilmente integrados eletrodos que são colocados e fixo fora da área de cultura, possibilitando a inspeção visual. Usando esses quatro eletrodos que a resistência de seis caminhos de medição pode ser quantificada, da qual a TEER pode ser diretamente isolada, independente da resistência de microcanais cheio de meio de cultura. A barreira hemato – encefálica foi replicada neste dispositivo e seu TEER foi monitorado para mostrar a aplicabilidade do dispositivo. Esse chip, os eléctrodos integrados e o método de determinação de TEER são geralmente aplicáveis em órgãos em chips, para imitar a outros órgãos ou a ser incorporados em sistemas existentes de órgão-em-microplaqueta.
Órgãos em chips são rapidamente emergindo como um novo e promissor classe in vitro , modelos de tecido. 1 nesses modelos, as células são cultivadas dentro de dispositivos microfluídicos que são projetados de tal forma que eles imitam o microambiente fisiológica dessas células. 1 , 2 isto resulta em comportamento fisiológico ou patológico mais realista dessas células do que pode ser esperado de modelos convencionais em vitro de design simples e função básica. 3 , 5 , 6 além disso, órgãos em chips fornecem um melhor ambiente controlável do que os modelos na vivo e podem incorporar tecidos saudáveis e doentes, de origem humana para replicar fielmente tanto humana fisiologia e patologia. Os avanços recentemente resumidos no desenvolvimento do sangue – cérebro barreiras em chips (BBBs em chips) mostram que o campo é rapidamente se movendo para a frente. 7
Outra vantagem de órgãos em chips é que eles permitem monitoramento em tempo real e contínua do tecido cultivado dentro do dispositivo por microscopia, análises bioquímicas on-line e sensores integrados. 1 , 2 por exemplo, medir a resistência elétrica transendothelial ou transepitelial (TEER) é um método poderoso para monitorização não invasiva, o desenvolvimento e o rompimento da barreira-formando tecidos. 8 , 9 , 10 TEER é a resistência elétrica através de uma barreira celular e, portanto, é indicativo da integridade da barreira e permeabilidade. 10 em órgãos em chips, barreiras celulares são geralmente cultivadas em uma membrana que separa dois canais fluídico, representando o apical e basolateral compartimentos de tecido essa barreira. Em tais fichas, medições de TEER podem ser convenientemente conduzidas com eletrodos inseridos as entradas e saídas dos dois canais. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 entretanto, inserção manual e reinserção dos eléctrodos podem facilmente resultar em erros de posicionamento e, portanto, variações na resistência medida como por exemplo, as diferenças na resistência dos caminhos mais longos ou mais curtos através de microcanais são significativas em comparação com a resistência de barreira de célula. 16 para eliminar erros de reinserção, dispositivos com eléctrodos integrados têm sido propostos. No entanto, a maioria destes eléctrodos integrados bloquear a vista quando inspecionando a cultura de tecido17,18,19,20,21 e/ou exigir especializados processos de salas limpas para a fabricação. 17 , 22
O dispositivo de órgão-em-microplaqueta descrito nesta publicação, foi aplicada pela primeira em uma publicação anterior,16 combina a estabilidade dos eléctrodos integrados com visibilidade sobre a camada de célula medido e fácil fabricação. O projeto e fabricação deste chip é retratada na Figura 1. Em suma, este dispositivo consiste de duas partes de polidimetilsiloxano (PDMS) com marcas de canal que são ligadas em conjunto escapamento livre com uma membrana de policarbonato com 0.4 µm poros no meio. Quatro eletrodos de fio de platina são inseridos e fixa no lugar com um photocurable adesivo bem fora da área de cultura. Todas estas etapas de fabricação podem ser conduzidas com equipamento geral de laboratório, sem a necessidade de um ambiente de sala limpa. Além disso, seis medições de impedância podem ser feitas usando esses quatro eletrodos, permitindo assim que o isolamento direto de TEER o medido, independente da resistência dos microcanais que antecederam a seção transversal e minimizando a influência de não-biológicos variações no sistema tais como (re) erros de inserção. 16
Para mostrar a aplicabilidade deste dispositivo e as medições de TEER diretas, que a barreira hemato – encefálica (BBB) foi replicada neste chip. Esta barreira biológica é composta de células endoteliais especializadas e regula o transporte entre o sangue e o cérebro para fornecer a homeostase do cérebro. 23 , 24 para imitar o BBB, o canal superior do dispositivo microfluidic foi forrado com células endoteliais microvasculares cerebrais humanas da linha celular hCMEC/D3 (gentilmente cedido pelo Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, França). 25 o método apresentado é, no entanto, mais geralmente aplicável para qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos, permitindo a determinação de TEER direta usando facilmente integrado a eletrodos.
Neste manuscrito, primeiro é descrito o processo de fabricação do dispositivo órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados. Próximo, o procedimento de semeadura e cultura de células endoteliais do cérebro dentro do dispositivo é explicado, bem como as medições de TEER no chip. Na seção de resultados, estão indicadas as medidas de TEER representativas e processamento de dados é esclarecido. Por último, a função de barreira do BBB-em-chip, monitorado durante 3 dias, é apresentada, mostrando a aplicabilidade do dispositivo apresentado e métodos para monitorar TEER.
Neste manuscrito, a engenharia de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta e a determinação direta da resistência transendothelial eléctrica (TEER) de uma barreira celular cultivada no dispositivo foram apresentados. O método apresentado de integrar eletrodos sem equipamento de salas limpas e a determinação de TEER direta usando quatro eletrodos é aplicável a qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos microfluidic. O layout de microplaqueta e geometria podem ser adaptados para atender os requisitos dos experimentos envisioned, contanto que os quatro eléctrodos são separados em dois compartimentos. Os quatro eletrodos podem mesmo ser convenientemente inseridos nas enseadas de fichas existentes, desde que eles são fixados no lugar para a duração das seis medições. O método de ligação livre de vazamento pode ser otimizado para diferentes membranas e geometrias de canal, alterando a relação PDMS/tolueno. Um teor mais elevado de tolueno resulta em uma camada mais fina spin-revestido de argamassa26 e pode ser mais apropriado para canais mais rasas e mais estreitos na parte PDMS. Um resultados de tolueno menor conteúdo em um almofariz mais espesso camada26 e podem ser mais apropriado para delimitar mais espessas membranas entre as partes PDMS.
Como pode ser visto nos espectros de impedância esquemática na Figura 2A e os espectros experimentais na Figura 2E e 2F, as medições de impedância são influenciadas pela capacitância da dupla camada na interface eletrodo-médio. Devido ao pequeno tamanho dos eletrodos dentro os microcanais, a capacitância da dupla camada pode dominar sobre o planalto resistivo da barreira celular nos espectros de impedância, complicando a quantificação de TEER o. Para superar isso, os eletrodos podem ser inseridos mais nos canais de cultura antes de fixação. Isto irá aumentar a área da superfície do eletrodo exposto com meio de cultura e com isso a capacitância da dupla camada aumentará também. Isso resulta em uma mudança da inclinação capacitiva para frequências mais baixas, para que o planalto resistivo da barreira celular pode ser mais facilmente reconhecido e quantificado. Embora a resistência do caminho medido entre dois eletrodos se tornará menor, isso não influenciará a quantificação de TEER o método apresentado a seguir.
Durante a medição através da barreira celular, é possível que o planalto extra resistivo não pode ser reconhecido. Isto pode ser o resultado de uma conexão fluídico entre os dois canais, por exemplo, se a membrana mal delimitada pelo morteiro, levando a um caminho medido próximo a barreira celular. Além disso, pode haver uma ponte elétrica fora o chip se os eléctrodos estão ligados por uma gota de meio de cultura. Isto é geralmente combinado com uma baixa impedância medida e pode ser resolvido removendo esta ponte do meio de cultura. Por último, se não há nenhum planalto resistivo e a impedância medida é ordens de magnitude maior do que o esperado, pode haver uma conexão frouxa na fiação elétrica ou na fonte de energia.
No futuro, a relevância fisiológica do atual BBB-em-chip pode ser aumentada, expondo as células endoteliais para distorcer o stress em níveis fisiológicos, que é relatado para promover tensão de barreira de diferenciação e aumento BBB e é difícil de alcançar em modelos convencionais em vitro . 29 além disso, o canal inferior do dispositivo apresentado fornece um compartimento apropriado para células derivado do cérebro para ser cultivadas co com o endotélio. Isso também é esperado para aumentar a função de barreira e também permite o estudo das interações complexas entre tipos de células relevantes sob condições patológicas. 29
Em conclusão, o órgão-em-microplaqueta dispositivo descrito nesta publicação pode ser fabricado utilizando equipamentos laboratoriais padrão e é mostrado para fornecer medições directas de TEER usando quatro eléctrodos integrados que não impedem a inspeção visual da célula estudada camada. A aplicabilidade deste dispositivo no campo de órgãos em chips foi demonstrada por imitando o BBB neste chip e monitoramento a TEER durante o período de cultura. Uma série de outros órgãos (barreira) pode ser imitada, incluindo outros tipos de células relevantes para este chip. Além disso, o método de medição TEER pode ser facilmente aplicado em outros dois dispositivos baseados no compartimento órgão-em-microplaqueta para chegar a valores TEER reprodutíveis e significativos que podem ser comparados através de dispositivos e sistemas.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos, com gratidão, Johan Bomer para fabricação do molde e Mathijs Bronkhorst para discussões frutuosas e assistência com a representação de dados.
Esta pesquisa foi financiada por: SRO biomédica Microdevices de L.I. Segerink, MIRA Instituto de engenharia biomédica e técnicos de medicina, Universidade de Twente; SRO órgãos em Chips de A.D. van der Meer, MIRA-Instituto de engenharia biomédica e técnicos de medicina, Universidade de Twente; e VESCEL, ERC Advanced Grant para r. van den Berg (grant, n. º 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |