この文書では、内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量の統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製について説明します。検証、このマイクロ流体デバイス内部の血液-脳関門をまねて、そのバリア機能をモニターしていた。電極の統合及び直接 TEER 定量化の提示方法は一般的に適用されます。
モデル体外臓器システムオン チップ、マイクロ流体デバイス内部組織の (人間) の文化を含むが急速に新興に便利を提供する約束研究と人間の健康と病を研究するためのツール。オルガンのオンチップ デバイス内培養細胞層のバリア機能を特徴付けるためしばしば内皮または上皮電気抵抗 (TEER) が測定されます。このため、電極は通常電極のチップの挿入マニュアルで達成されるよりもより安定した測定を提供するために微細加工方法でチップに統合されます。ただし、これらの電極はよく研究細胞層の目視検査を妨げるまたは作製のための高価なクリーン ルーム工程を必要とします。これらの制限を克服するためには、ここで説明されているデバイスには置かれ、目視検査を可能に作る文化圏の外固定電極が 4 容易に統合が含まれています。元、TEER 直接分離できます、培地充てんマイクロ流路の抵抗の独立した六つの測定パスの抵抗を定量化することができます、これらの 4 つの電極を使用してください。血液脳関門は、このデバイスでレプリケートされた、その TEER がデバイスへの適用性を表示する監視だった。このチップ、電極が統合、TEER 定量法は、臓器-システムオン チップ、他の器官を模倣するまたは、既存の器官のオンチップ システムに組み込むことで一般的に適用されます。
臓器にチップは新しい新興かつ有望なクラスの in vitro組織モデル。1これらのモデルでは細胞、培養それらの細胞の生理学的な微小環境を模倣するように設計されているマイクロ流体デバイスの内部。1,2その結果、それらの細胞のより現実的な生理学的または病理学的行動よりもシンプルなデザインと基本的な機能の従来の in vitroモデルから予想されることができます。3,5,6また、臓器にチップは体内のモデルよりもより良い制御環境を提供、人間生理学および病理学を忠実に再現する人間の起源から健康と病気の組織を組み込むことができます。チップ (チップ上の BBBs) 血液-脳障壁の開発の最近要約進歩を示すフィールドが進む迅速に動いています。7
臓器システムオン チップの別の利点は、顕微鏡、オンラインの生化学的解析と統合センサー デバイス内培養組織のリアルタイムおよび継続的な監視を有効にします。1,2たとえば、非侵襲的開発を監視するための強力な方法は、内皮や上皮電気抵抗 (TEER) 測定およびバリア形成の組織。8,9,10 TEER 電気抵抗細胞の境界を越えた、したがって関門の透過性を示す。10の器官のチップに 2 つの頂を表す、流路とそのバリア組織の基底外側コンパートメントを分離膜には一般的に細胞障壁、培養します。このようなチップの入口および 2 つのチャネルの出口に挿入された電極との TEER 測定を便利に実施できます。3,4,11,12,13,14,15ただし、手動で挿入し、電極の再挿入簡単に結果、配置エラー、従って例えばとして測定の抵抗の変化でマイクロ チャネルを介した長いまたは短いパスの抵抗性の差異重要なと比較される細胞壁の抵抗。16再挿入エラーを避けるためには、統合された電極を持つデバイスが提案されています。ただし、これらの統合された電極のほとんど培養17,18,19,20,21を検査する際にビューをブロックやを必要とする特殊な作製するプロセスのクリーン ルーム。17,22
まず以前の出版物、16に適用し、文書に記載されている臓器のオンチップ デバイスは、測定細胞層とを容易に作製に関する可視性と統合された電極の安定性を兼ね備えています。デザイン、このチップの作製は、図 1に描かれています。一言で言えば、このデバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) の 2 つの部分で構成されています一緒に結合しているチャネル出版社と 0.4 とポリカーボネート膜と液洩れのない μ m 孔間に。4 つの白金線電極を挿入し、硬化を所定の位置に固定の文化圏の外によく接着します。すべての製作手順は、一般的な実験装置、クリーン ルーム環境を必要とせずに実施できます。この上に、六つのインピー ダンス測定を行うことができますマイクロ流路断面に至るまでとの影響を最小限に抑えるための抵抗の独立した測定 TEER の直接分離ができるこれらの 4 つの電極を使用して(再) 挿入エラーなどシステムの非生物学的変化。16
血液脳関門 (BBB) は、このチップでレプリケートされたこのデバイスと直接 TEER 測定の有効性を示す。この生物学的障壁から成っている専門にされた血管内皮細胞と血液と脳の恒常性を提供するために脳の間の輸送を調節します。23,24 BBB を模倣するには、マイクロ流体デバイスの最上位のチャネルは (親切提供される博士 p. o. によって hCMEC/D3 細胞ラインから人間の脳微小血管内皮細胞が並んでいたCouraud、INSERM パリ, フランス).25 , 提案手法が、ただしより一般的に 2 つのコンパートメントを持つ任意の臓器のオンチップ デバイスに適用可能な簡単に使用して直接 TEER 定量を有効にする統合電極。
この原稿の最初統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製プロセスを説明です。次、シードのプロシージャおよびデバイス内脳血管内皮細胞の培養は、オンチップ TEER 測定だけでなく、説明です。[結果] セクションで、代表的な TEER 測定し、データ処理を明らかにしました。最後に、提示装置と TEER を監視する方法の有効性を示す、BBB-オン-チップ、3 日間、監視のバリア機能が表示されます。
本稿では、オルガンのオンチップ デバイスの技術とデバイスで培養した細胞壁の内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量が発表されました。クリーン ルーム内機器と 4 つの電極を用いた定量 TEER なし電極の統合の提案手法は、マイクロ流路の 2 つのコンパートメントを持つ任意の臓器のオンチップ デバイスに適用されます。チップ レイアウトとジオメトリは、4 つの電極が 2 つの区画に区切られている限り、想定実験の要件に合うように適応することができます。4 電極は、される六つの測定の間の場所に執着に既存のチップの入り江に便利な挿入もできます。液洩れのない接着工法は、PDMS/トルエンの比を変更することによって異なる膜とチャネル形状の最適化できます。高いトルエン含有モルタル26の薄いスピン コーティング層に結果し、PDMS の部分に浅く、狭いチャネルのより適切な場合があります。厚いモルタルで低いトルエン コンテンツ結果26層し、PDMS の部分の間の厚い膜を囲むより適切な場合があります。
図 2 aの回路インピー ダンス スペクトルおよび図 2 e および 2 fの実験的スペクトルに見られる、インピー ダンス測定電極中の界面における二重層容量に影響されます。マイクロ チャネルの内部電極のサイズが小さいため、TEER の定量化を複雑なインピー ダンス スペクトルにおける細胞壁の抵抗高原上二重層容量を支配できます。これを克服するために電極を挿入ことができます文化チャンネル固定の前にさらに。これは公開されている電極の表面積を増加同様二重層容量に拡大培養液とします。細胞壁の抵抗の高原はより簡単に認識し定量化することができますように、低い周波数に静電容量式の斜面のシフトでこの結果します。2 つの電極間の測定パスの抵抗がより小さくなる、これ、次の提示法 TEER 定量化を影響しません。
細胞壁を測定しながら余分な抵抗の高原を認識できないということです。これは、膜は細胞のバリアの周囲測定パスにつながる、モルタルで囲まれた不十分な場合など、2 つのチャネル間の流体接続の結果をすることができます。さらに、あります培養液の液滴によって電極が接続されている場合は、チップ外電気ブリッジです。これは一般的に低いインピー ダンス測定と組み合わせるし、培地のこの橋を削除することによって解決することができます。最後に、抵抗高原はありません、インピー ダンス測定は桁違いに予想よりも高い場合は、電気配線や電源接続の緩みが可能性があります。
BBB の分化と増加バリアの気密性を促進するために報告され、達成しにくい、生理学的なレベルでストレスをせん断する内皮細胞を公開することによって、将来、現在チップに BBB の生理学的な関連性を増やすことができます。従来の in vitroモデル。29また、提示デバイスの下部のチャンネルは、脳由来細胞、血管内皮細胞と共培養するのに適切なコンパートメントを提供します。これはバリア機能の増加が期待されるも、病理学的条件下での関連するセル型の間の複雑な相互作用の研究ができます。29
結論としては、この資料に記載される器官のオンチップ デバイス標準実験装置を使用して作製することができ、調査セルの外観検査を阻害しない 4 つの統合された電極を用いた直接 TEER 測定を提供するために示されています。レイヤー。このチップで BBB を模倣して文化期、TEER の監視臓器システムオン チップ フィールドでこのデバイスの適用性を示した。(バリア) の他の臓器のホストは、このチップを他の関連の細胞型を含めることによってまねることができます。さらに、デバイスやシステム間で比較できるように、再現性の高い、有意義な TEER 値に到着する他 2 つのコンパートメントに基づく臓器のオンチップ デバイスで TEER の測定方法を簡単に適用できます。
The authors have nothing to disclose.
我々 は感謝して有意義な議論と支援のデータ表現とカビや脊髄ブロンクホールスト作製のヨハン · ボーマーを認めます。
この研究によって資金が供給された: 特任医工業マイクロ デバイスの l. i. Segerink、ミラ トエンテ大学医用生体工学技術研究臓器にチップ ミラ研究所西暦ファンデルメール トエンテ大学医用生体工学技術研究特任ERC 助成金 A. ・ ヴァン ・ デン ・ ベルク (グラント号 669768) に高度な VESCEL。
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |