Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed – hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.
Organen-op-chips, in vitro modellen waarbij de cultuur van (menselijke) weefsels binnen microfluidic apparaten, zijn snel opkomende en belofte aan nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van de menselijke gezondheid en ziekte onderzoek. Karakteriseren de barrièrefunctie van cel lagen binnen orgel-on-chip apparaten gekweekt, wordt vaak signaalcomplexen of transepithelial elektrische weerstand (TEER) gemeten. Te dien einde zijn elektroden meestal geïntegreerd in de chip door Microbewerking methoden om meer stabiele metingen dan met handmatige invoer van elektroden in de inhammen van de chip. Echter deze elektroden vaak visueel onderzoek van de bestudeerde cellaag belemmeren of vereisen dure cleanroom processen voor fabricage. Deze beperkingen wilt opheffen, bevat het hier beschreven apparaat vier gemakkelijk geïntegreerde elektroden die zijn geplaatst en vaste buiten het gebied van cultuur, visuele inspectie mogelijk te maken. Met behulp van deze vier elektroden die de weerstand van zes meting paden kan worden gekwantificeerd, waaruit de TEER kan worden rechtstreeks geïsoleerd, onafhankelijk van de weerstand van kweekmedium gevulde microchannels. De bloed – hersen-barrière is gerepliceerd in dit apparaat en zijn TEER was gecontroleerd zodat de toepasbaarheid van het apparaat. Deze chip, de geïntegreerde elektroden en de methode voor TEER sleutelbepaling gelden over het algemeen in organen-op-chips, zowel om na te bootsen andere organen of te integreren in bestaande orgel-on-chip systemen.
Organen-op-chips zijn snel ontpopt zich als een nieuwe en veelbelovende klasse van in vitro weefsel modellen. 1 in deze modellen, cellen worden gekweekt in microfluidic-apparaten die zijn ontworpen op een zodanige wijze dat zij de fysiologische communicatie van die cellen bootsen. 1 , 2 dit resulteert in meer realistische fysiologische of pathologische gedrag van die cellen dan conventionele in vitro modellen van eenvoudig ontwerp en basisfunctie kan verwachten. 3 , 5 , 6 voorts organen-op-chips zorgen voor een beter beheersbare omgeving dan in vivo modellen en kunnen nemen zowel in gezonde als zieke weefsels van menselijke oorsprong om te repliceren getrouw zowel menselijke fysiologie en pathologie. De onlangs samengevatte vooruitgang in de ontwikkeling van blood – brain belemmeringen op chips (BBBs-op-chips) tonen aan dat het veld snel bewegende vooruit. 7
Een ander voordeel van organen-op-chips is dat ze in staat stellen real-time en doorlopende bewaking van het weefsel gekweekte binnen in het apparaat door microscopie, on-line biochemische analysen en geïntegreerde sensoren. 1 , 2 bijvoorbeeld, het meten van signaalcomplexen of transepithelial elektrische weerstand (TEER) is een krachtige methode om het toezicht op niet-gebeurt de ontwikkeling en verstoring van de barrière-vormende weefsels. 8 , 9 , 10 TEER is de elektrische weerstand over een cellulaire barrière en is daarom een indicatie van de barrière integriteit en de permeabiliteit. 10 in organen-op-chips, cellulaire barrières worden algemeen gekweekt op een membraan die scheidt twee fluidic kanalen, die vertegenwoordigt het apicale en basolaterale compartimenten van dat weefsel barrière. In dergelijke spaanders, kunnen TEER metingen gunstig plaatsvinden met elektroden ingevoegd in de inhammen en de afzetmogelijkheden van de twee kanalen. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter handmatige invoer en herintegratie van de elektroden kunnen gemakkelijk resulteren in plaatsing fouten en dus variaties in de gemeten weerstand als bijvoorbeeld de verschillen in de weerstand van langere of kortere paden door microchannels aanzienlijk worden vergeleken met de cel barrière weerstand. 16 te elimineren herintegratie fouten, apparaten met geïntegreerde elektroden zijn voorgesteld. Echter, de meeste van deze geïntegreerde elektroden blokkeren de weergave bij de inspectie van de weefselkweek17,18,19,20,21 en/of vereisen gespecialiseerde Cleanroom procédés voor de fabricage. 17 , 22
Het orgel-on-chip-apparaat zoals beschreven in deze publicatie, voor het eerst toegepast in een eerdere publicatie,16 combineert de stabiliteit van geïntegreerde elektroden met zicht op de gemeten cellaag en gemakkelijk fabricage. Het ontwerp en de fabricage van deze chip is afgebeeld in Figuur 1. Kortom, dit apparaat bestaat uit twee Polydimethylsiloxaan (PDMS) delen met kanaal opdrukken die zijn samen gebonden lekkage-vrij met een polycarbonaat membraan met 0.4 µm poriën tussendoor. Vier platina draad elektroden zijn ingevoegd en vastgesteld op zijn plaats met een photocurable lijm goed buiten het gebied van cultuur. Al deze stappen fabricage kan plaatsvinden met algemene laboratoriumapparatuur, zonder de noodzaak voor een cleanroom-omgeving. Op de top van dit, zes impedantie metingen kunnen worden gedaan met behulp van deze vier elektroden, waardoor directe isolatie van de gemeten TEER, onafhankelijk van de weerstand van de microchannels voorafgaand aan de doorsnede en dus het minimaliseren van de invloed van niet-biologische variaties in het systeem zoals (her) plaatsingskosten fouten. 16
Om te laten zien de toepasselijkheid van dit apparaat en de directe metingen van de TEER, dat de bloed – hersenbarrière (BBB) in deze chip is gerepliceerd. Deze biologische barrière bestaat uit gespecialiseerde endotheliale cellen en regelt vervoer tussen bloed en hersenen aan hersenen homeostase bieden. 23 , 24 om na te bootsen de BBB, het bovenste kanaal van het microfluidic-apparaat was bekleed met menselijke cerebrale microvasculaire endotheliale cellen van de cellijn van de hCMEC/D3 (vriendelijk geleverd door Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Parijs, Frankrijk). 25 de onderhavige methode is, echter meer in het algemeen van toepassing op elk apparaat orgel-on-chip met twee compartimenten, waardoor directe TEER bepaling gemakkelijk met geïntegreerde elektroden.
In dit manuscript, voor het eerst het fabricageproces van het orgel-on-chip-apparaat met geïntegreerde elektroden is beschreven. Volgende, de seeding procedure en cultuur van de endotheliale cellen van de hersenen binnen in het apparaat wordt uitgelegd, alsook de metingen van de TEER op de chip. Representatieve metingen van de TEER worden weergegeven in de sectie resultaten en gegevensverwerking wordt verduidelijkt. Tot slot is de barrièrefunctie van de BBB-on-chip, gedurende 3 dagen, gevolgd gepresenteerd, met inbegrip van de toepasselijkheid van de gepresenteerde apparaat en methoden voor het controleren van TEER.
In dit manuscript, werden de engineering van een orgel-on-chip-apparaat en de directe bepaling van de signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER) van een cellulaire barrière gekweekt in het apparaat gepresenteerd. De onderhavige methode elektroden zonder cleanroom apparatuur en de directe TEER bepaling met behulp van vier elektroden te integreren is van toepassing op elk apparaat orgel-on-chip met twee compartimenten van de microfluidic. De indeling van de chip en de meetkunde kunnen worden aangepast aan de eisen van de beoogde experimenten, zolang de vier elektroden worden gescheiden in twee compartimenten. De vier elektroden kunnen zelfs gunstig in de inhammen van bestaande fiches, worden ingevoegd, op voorwaarde dat ze zijn gefixeerd op zijn plaats voor de duur van de zes metingen. De lekkage-vrije hechting-methode kan worden geoptimaliseerd voor verschillende membranen en kanaal meetkundes door het veranderen van de verhouding tussen de PDMS/tolueen. Een hoger gehalte aan tolueen resulteert in een dunnere spin-gecoate laag mortel26 en wellicht meer geschikt voor ondieper en smaller kanalen in de PDMS delen. Een lagere tolueen inhoud resultaten in een dikkere Mortier laag26 en wellicht meer geschikt voor dikkere membranen tussen de PDMS onderdelen omsluiten.
Zoals kan worden gezien in de schematische impedantie spectra in figuur 2A en de experimentele spectra in figuur 2E en 2F, worden de impedantie metingen beïnvloed door de capaciteit van de dubbele laag op de elektrode-medium-interface. Als gevolg van de geringe omvang van de elektroden binnen de microchannels, kan de dubbele laag capaciteit domineren over de resistieve plateau van de cellulaire barrière in impedantie spectra, complicerende kwantificering van de TEER. Om dit te verhelpen, de elektroden kunnen worden ingevoegd verder in de kanalen van de cultuur voor fixatie. Dit zal het verhogen van de oppervlakte van de elektrode blootgesteld aan het kweekmedium en daarmee de dubbellaagse capaciteit ook zal toenemen. Dit resulteert in een verschuiving van de capacitieve helling aan lagere frequenties, zodat de resistieve plateau van de cellulaire barrière gemakkelijker herkend en gekwantificeerde worden kan. Hoewel de weerstand van het gemeten pad tussen twee elektroden kleiner worden zal, zal dit geen invloed op de kwantificering van de TEER na de onderhavige methode.
Tijdens het meten via de cellulaire barrière, is het mogelijk dat het extra resistieve plateau niet wordt herkend. Dit kan zijn het resultaat van een fluidic verbinding tussen de twee kanalen, bijvoorbeeld als het membraan is slecht omsloten door de mortel, wat leidt tot een gemeten pad rond de cellulaire barrière. Daarnaast kan er elektrische overbruggen buiten de chip als de elektroden zijn verbonden door een druppel van kweekmedium. Dit wordt doorgaans gecombineerd met een lagere impedantie van de gemeten en kan worden opgelost door het verwijderen van deze brug van kweekmedium. Tot slot, als er geen resistieve plateau en de gemeten impedantie ordes van grootte hoger is dan verwacht, kan er een losse verbinding in de bedrading of op de stroombron.
In de toekomst kan de fysiologische relevantie van de huidige BBB-on-chip worden verhoogd door het blootstellen van de endotheliale cellen als u wilt schuintrekken stress op fysiologische niveaus, die aan het bevorderen van BBB differentiatie en verhoging van dichtheid van de barrière is gemeld en is moeilijk te bereiken in conventionele in vitro modellen. 29 het kanaal van de onderkant van de gepresenteerde apparaat biedt bovendien een geschikt compartiment voor hersenen-afgeleide cellen te samen met het endotheel worden gekweekt. Dit ook naar verwachting toenemen de barrièrefunctie en maakt het ook mogelijk de studie van de complexe interacties tussen de relevante celtypes onder pathologische omstandigheden. 29
Kortom, het orgel-on-chip-apparaat zoals beschreven in deze publicatie kan worden vervaardigd met behulp van de gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden en wordt getoond aan het bieden van directe TEER metingen met behulp van vier geïntegreerde elektroden die visuele inspectie van de bestudeerde cel niet belemmeren laag. De toepasselijkheid van dit apparaat op het gebied van de organen-op-chips werd aangetoond door het nabootsen van de BBB in deze chip en controle van de TEER tijdens de periode van de cultuur. Een gastheer van andere organen (barrier) kan worden geïmiteerd door andere relevante celtypes in deze chip. Bovendien, kan de methode voor het meten van de TEER gemakkelijk worden toegepast in andere twee compartiment-orgel-on-chip apparaten om tot reproduceerbare en zinvolle TEER waarden die kunnen worden vergeleken op apparaten en systemen te komen.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen dankbaar Johan Bomer voor de fabricage van de schimmel en Mathijs Bronkhorst voor vruchtbare discussies en hulp bij gegevensvertegenwoordiging.
Dit onderzoek werd gefinancierd door: SRO biomedische Microdevices van L.I. Segerink, MIRA Instituut voor biomedische technologie en technische geneeskunde, Universiteit Twente; SRO organen-op-Chips van A.D. van der Meer, MIRA Instituut voor biomedische technologie en technische geneeskunde, Universiteit Twente; en VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |