概要

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Published: November 13, 2017
doi:

概要

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの研究者採用できます。

Abstract

高スループット シーケンス (seq ATAC) とトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、クロマチンのオープン (アクセス) 領域の識別に使われる方法です。これらの地域は、転写因子をバインド規制の DNA 要素 (例えばプロモーター、エンハンサー、軌跡のコントロール領域、絶縁体) を表します。アクセス可能なクロマチン風景をマッピングは、ゲノム全体で暴くアクティブ規制要素の強力なアプローチです。この情報は、関連する転写因子ネットワーク、遺伝子発現プログラムを制御するクロマチン構造のメカニズムを発見するための公平なアプローチとして機能します。ATAC seq は DNase の堅牢な代替私過敏性解析は次世代シーケンス (seq DNase) とクロマチンのゲノム解析のため規制要素 (放任 seq) のホルムアルデヒドによる分離と相まってアクセシビリティと micrococcal のヌクレアーゼ感受性サイト ヌクレオソームの配置を決定する (MNase seq) の塩基配列の決定。人間の主な免疫細胞すなわちcd4 リンパ球に最適化した詳細な ATAC seq プロトコルを提案 (T ヘルパー 1 (Th1) と Th2 細胞)。この包括的なプロトコル細胞収穫始まるクロマチン tagmentation、次世代シーケンシングの前処理の分子プロシージャを記述し、方法および計算の分析するために使用に関する考慮事項も含まれます結果を解釈します。さらに、時間とお金を節約するシーケンスの前に ATAC seq ライブラリを評価する品質への取り組みを紹介します。重要なは、このプロトコルで説明した原則は、他のひと免疫系と非免疫細胞と細胞への適応を許可します。これらのガイドラインは次世代シーケンシング方法と熟練ではない研究所の役に立ちます。

Introduction

ATAC seq1,2は、ヌクレオソームの配置規制3クロマチン領域の同定を可能にする堅牢な方法です。この情報は、場所、id、および転写因子の活性を推定のために適用されます。クロマチン構造の定量的変化の測定法の感度では、クロマチンの remodelers 修飾子と RNA ポリメラーゼ II1の転写活性を含むクロマチン因子の活性の検討をことができます。したがって ATAC seq は興味の任意のセル型の転写制御を支配するメカニズムを解読するため強力かつ公平なアプローチを提供します。ATAC seq の主なヒト th1 細胞や Th2 細胞への適応について述べる。

ATAC-seq に非常に活発の Tn5 トランスポザーゼはアダプター (すなわち、「tagmentation」プロセス)1DNA のタグ付けされた次世代シーケンサー (NGS) カップル DNA 断片化アダプターを搭載。得られた DNA ライブラリー PCR 増幅、次次世代シーケンス (図 1) の準備ができました。アクセス可能なクロマチンの優遇の tagmentation は、ATAC seq 配列読み取りのローカル富の分析によって検出されます。

短い実験手順とクロマチン アクセシビリティと DNase seq4、放任 seq5、および MNase seq6などヌクレオソームの位置を測定するための他の方法を基準にして以下の原料のための要件は、します。人間の一次電池1,7臨床サンプル8と同様と単細胞生物9植物10、ショウジョウバエ11 を含む複数の生物学的システムでは ATAC seq の使用を促進と様々 な哺乳類12

アクセスの軌跡にバインドされている要素は、バインド シーケンス モチーフの濃縮を分析または高スループット DNA シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降 (チップ) と ATAC seq を組み合わせることで発見ことができます転写の idChIP-seq)。このアプローチは、マウス13での造血機構の重要な系統特異的転写因子の同定を有効にします。ATAC seq の公平かつグローバルな性質をチップ解析のための抗体などの試薬が利用できない有機体の遺伝子の規則を勉強することができます。Cis 諸国における進化バリエーションなど-初期マウス規制要素の発達的変動からヒトとチンパンジー14、頭部神経堤細胞の研究によって識別された規制地域胚15日は単細胞C. owzarzakiのライフ サイクル中に規制動向の変化9、およびプロモーターやエンハンサー1220 の哺乳類の種の間での進化。

ATAC seq はまた単一細胞におけるクロマチン アクセシビリティ通常ゲノム研究7,16を忌避する細胞集団内でこのように明らか変動を測定するため尽力されています。さらに、サンプルはまれな病態での遺伝子制御領域で発生した変更を勉強する ATAC seq を使用できます。急性骨髄性白血病 (AML)17またはRasの発症時規制の風景の変化を研究する ATAC seq を使用できますたとえば、-発癌11を駆動します。

Protocol

Bar Ilan 大学の倫理委員会で承認されたすべての手順とプロトコル実験を承認する委員会によって提供されるガイドラインに従います。 1。 浄化のナイーブ cd4 細胞とヘルパー t1 (Th1) と Th2 細胞に偏光 注: ここで冷凍のひと末梢血単核球 (PBMCs) から始まる手順について述べる。まず cd 4 + 細胞のマイクロ ビーズを使用して分離することで構成され、列?…

Representative Results

このプロトコルの最終的な結果は、通常 3-20 ng/μ L の ATAC seq ライブラリです。DNA ・ インテグリティ解析のシステムで実行すると (材料/機器のテーブル参照)、はしごのような外観2 (図 3 a) を見せます。DNA のフラグメントの平均サイズは通常 〜 450 530 bp です。 次世代シ?…

Discussion

ここで記述されている ATAC seq プロトコルは一次電池でアクセス可能なクロマチンの分析のため正常に採用されている (ヒト th1 細胞、Th2 細胞、B 細胞) 培養細胞株 (MCF10A ひと乳癌細胞と U261 神経膠芽腫細胞) だけでなく。ATAC seq を他の細胞型に適用すると、散のステップを中心に、いくつかのプロトコルの最適化が必要です。非イオン性洗剤の濃度が高すぎる、ミトコンドリアの DNA 汚染の割?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品はイスラエル科学財団 (グラント 748/14) でサポートされている、マリー キュリーの統合 (CIG) を付与 – FP7 人 20013 CIG 618763 とコア計画と予算委員会とイスラエル科学財団のプログラム許可第 41/11。

Materials

50 mL tubes Lumitron LUM-CFT011500-P Can be from other vendors.
Microtubes Axygen Inc MCT-175-C Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes Corning Costar 4489 Can be from other vendors.
Tissue culture flask Lumitron LUM-TCF-012-250-P Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter Invitrogen C10227
NucleoSpin Tissue MACHEREY-NAGEL 740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ATCC  PCS­800­011 Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium Biological Industries 01-103-1A Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM) Biological Industries 03-020-1B Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin Biological Industries 03-031-1B Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade Biological Industries 04-127-1 Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Human CD4 FITC Biogems 06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC Biogems 44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3) Tonbo biosciences 40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified Biogems 10311-25
Recombinant Human IL2 Peprotech 200-02
Recombinant Human IL4 Peprotech 200-04
Recombinant Human IL12 p70 Peprotech 200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) Tonbo 40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ BioLegend 506513
NaCl, analytical grade Carlo Erba 479687 Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade Calbiochem 442611 Can be from other vendors.
EDTA MP Biomedicals 800682 Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure MP Biomedicals 819620 Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) Calbiochem 492016 Can be from other vendors.
Protease Inhibitors Sigma P2714 this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads Beckman 63881
PCR purification kit HyLabs EX-GP200 Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) Illumina FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix New England BioLabs M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543
SYBR Green I  Invitrogen S7585
 CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-rad 185-5200 Can be from other vendors.
CFX Manager Software Bio-rad 1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad 172-5124 Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0 Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
Magnet for eppendorf tubes Invitrogen 12321D Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes Thermo Scientific 75004527 Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker MRC Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5585
4200 TapeStation system Agilent Technologies G2991AA Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626 Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'
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Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
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Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
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 Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
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Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
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 Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
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 Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
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Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
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Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
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Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
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F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' IDT

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記事を引用
Grbesa, I., Tannenbaum, M., Sarusi-Portuguez, A., Schwartz, M., Hakim, O. Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq. J. Vis. Exp. (129), e56313, doi:10.3791/56313 (2017).

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