Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Aşağıda belirtilen iletişim kuralı etkileri BPA maruz kalma sırasında (erken) embriyo test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDC piliç embriyonik nöronlar içinde kullanılmak üzere değiştirilebilir. Bu iletişim kuralı Delaware Eyalet Üniversitesi Kurumsal ilkeleri ve kuş embriyo NIH poliçesinin izler. Protokol Ayrıca onay DSU’ın malzeme ve kimyasal güvenlik yönergeleri ile mevcuttur. 1. malzeme Kur BPA (m.w. 228.29) % 10 etanol (v/v) yapmak a 1 mM hisse senedi eriyik (mL % 10 etanol 0,23 mg) suda çözülür. Sonraki dilutions (0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM) neurobasal ortamda yapmak.Dikkat: BPA çevresel bir toksindir ve bakım tozu ele alırken edilmelidir. Piyasada bulunan bir masa üstü kuluçka 37 ° C’de piliç yumurta kuluçkaya Yumurta E7 embriyo 7 gün kuluçkaya. 3-4 h için % 70 etanol ıslatarak bana gerekli sayıda ölçü birimi Sterilize hazırlamak ve sonra üç kez içinde yaklaşık 10 mL steril distile su BSLII Hood durulayın.Not: Bana bir 8 x 8 kılavuz düzenlenmiş 64 nanoporous Platin elektrotlar içerir. Elektrot çapı 30 µm ve elektrotlar arasındaki aralığı 200 µm. Denatüre etanol gibi bu MEA korozyona yol açacaktır Guinan sterilizasyon için kullanmayın. (Steril koşullar korumak için) bana kapak ile steril bir kap içine yerleştirin ve bir masa üstü kuluçka için hareket. En az 6 saat 55 ° C’de pişirin Bu uygun sterilizasyon için kritik bir adımdır ve sıcaklık 60 ° C. geçmemelidir Kısırlık Bakımı, bana BSLII hood için depolama için daha fazla kullanımı kadar içeren yemek taşımak.Not: Biz plastik kapak ile bir fırın güvenli cam pişirme çanağı kullanın ve yüzey sterilize % 70 etanol ve kurutma için BSLII hood yerde. Aliquot ekstra hücresel matris ECM çözümü. Şişeyi 4 ° C’de gecede çözülme ve 100 µL aliquots-20 ° C’de dondurmakNot: ECM donmuş sevk edilir. ECM oda sıcaklığına kadar hazır oda sıcaklığında polymerizes ve sonra polimerli, bu ceket için imkansız gibi kat için getirilmelidir değil. ECM büyüme faktörleri olmadan Bilinmeyen faktörler nedeniyle ek etkileri önlemek için tercih edilir. Tüm diseksiyon aletleri (Dumont #5 forseps, kıvrımlı pensler, küçük makas ve bahar makas) sterilize ve kendinden contalı malzeme diseksiyon yemekleri % 70 etanol ile kaplı ve koyup diseksiyon mahallede kuruyuncaya kadar bırakın. 2. piliç embriyonik nöron kültürü ve ağ etkinliğini Kaplama günü, bir şişe kaldırmak % 70 etanol ile-20 ° C-dondurucu dan ECM sprey ve Buza koyun. % 25’e 300 µL soğuk neurobasal orta BSLII hood içine ekleyerek sulandırmak. Bir P200 pipetteman eklemek 100 µL % 25 ECM elektrotlar dokunmaya değil ve yüzeyde ince bir film ayrılmadan hemen kaldırmak için dikkat çekici MEA ortasına. MEA kapak ve nöronlar plaka için hazır kadar CO2 kuluçka (37 ° C ve % 5 CO2) yerleştirin. E7 yumurta (embriyonik gün 7, 7 gün süreyle 37 ° C’de inkübe) dış kabuğunun % 70 etanol ile sterilize. Embriyo soğuk steril Hank’in dengeli tuzlar çözüm (HBSS) kalsiyum olmadan içeren bir Sylgard alt diseksiyon çanak içine başını kesmek. Göz çevresi kesmek ve gözbebekleri kaldırın. DuMont #5 kullanarak ince forseps ve bahar makas ventral tarafta bir kesi yapın ve dış katmanlarını deri ön ve optik tectum ortaya çıkarmak için kaldırın. Soyma ve pial membran dikkatli bir şekilde çıkarın. Ön başka bir petri kabına aktarın ve bahar makasla yaklaşık 2 mm küçük parçalar halinde kes.Not: Değil herhangi bir kan damarları için ön pial membran çıkarıldıktan sonra bağlı olmalıdır. Aletleri ve diseksiyon alanı iyice % 70 etanol ile sterilize sürece bir başlık dışında diseksiyon gerçekleştirildiğinde oldukça iyi sonuçlar elde varsa, diseksiyon bir steril diseksiyon başlık, gerçekleştirmek için tercih olsa da . Steril transfer pipet kullanarak, bir 15 mL santrifüj tüpüne ön parçaları toplamak ve HBSS mümkün olduğunca daha fazla ön lavabo santrifüj tüpü dibine parçalarını icar sonra kaldırın. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin/EDTA (37 ° C için önceden ısındı) ve 37 ° C’de 15 dakika boyunca kuluçkaya. Pasteur pipet kullanarak, dikkatle doku parçaları bozmadan tripsin kaldırın ve 1 mL neurobasal orta ekleyin. Doku Lavabonun altına parçaları izin ve orta kaldırın. Bu yıkama bir kez daha yineleyin. Bu adım tripsin/EDTA yıkayın etmektir. Neurobasal orta 2 mL ekleyin ve triturating başlar. Toz steril bir yangın cilalı Pasteur pipet alarak ve doku yok daha fazla parçalar görülür kadar doku o ile birkaç kez hafifçe geçen içerir. Herhangi bir adet sonra tekrarlanan geçer kalırsa, sadece altına yerleşmek bırakın.Not: köpük oluşturmak, durup, aspirasyon tarafından kaldırmak – triturating süre renginde solma kaçının. Yeniden askıya alınan hücreler 1:10 neurobasal orta ile sulandırmak ve hücrelerin Trypan mavi boya ve bir hemasitometre kullanarak say. Mix 50 µL 0.5 mL santrifüj tüpü Trypan mavi çözümün 50 µL ile seyreltilmiş hücre. Coverslip koyduktan sonra hemacytometer için 10 µL ekleyin ve parlak açık hücreleri (mavi hücreler öldü ve yok sayılması) saymak.Not: Tipik cep numaraları 1 ile 5 x 107 hücre/mL arasında tek E7 optik tectum aralığından. Disosiye plaka ECM hücrelerdeyse 2200 hücreler/kare mm bir yoğunluk Guinan kaplı. MEA sistemimiz için bu MEA başına yaklaşık 130.000 hücre çevirir. Birim içinde MEA için 1 mL getirmek ve CO2 kuluçka hücre eki ve neurite (şekil 1) uzantısı için bir gecede bana yer neurobasal orta ekleyin.Not: Farklı alanlarda ve elektrot numaraları Guinan farklı hücre yoğunluğu çalıştı – genel olarak, daha yüksek hücre yoğunluğu büyük ağ faaliyet sonuçları, ama aynı zamanda daha kısa ömürlü kültürler için yol açar. Ertesi gün, adım 1.1 için tedavi MEA yapılan 1 mM stoktan neurobasal ortamda 10 µM son bir konsantrasyon için BPA ekleyin. Denetime MEA, % 10 etanol aynı birim su (v/v) çözüm ekleyin. Harcanan orta neurobasal orta içeren 10 µM ile BPA her geçen gün 7 gün vitro (7DIV) ve bundan sonra her gün kadar ağ aktivite arttıkça değiştirin.Not: ağ aktivite arttıkça, metabolik aktiviteyi artırır ve medya değişikliklerini daha sık olması gerekir. Turuncu açmak orta izin vermeyin. 3. kayıt nöronal ağ etkinliğini Satın alma günü, taze neurobasal orta ile Kültür ortam değişimi ve ölçü CO2 kuluçka en az 2 h kayıt önce geri dönün. Kayıt yazılımı çalıştırın ve MEA sıcaklığı 37 ° C sıcaklık ikonuna tıklayarak ayarlayın (tamamlayıcı şekil 3.1a-b).Not: Kayıt günü 3 kaplama olarak erken başlayabilir ve kültürler hayatta olduğu sürece devam edebilirsiniz. (Altında akarsu sol pencerede Masası’nda) “Muse” ikonuna tıklayarak satın alma parametrelerini ayarlamak ve “işleme Ekle” ve “Spike dedektörü” seçin ve pencere açılır içinde Tamam’ı tıklatın. “Spike dedektörü (6 x STD)” dosya adının altında görünür (tamamlayıcı şekil 3.2a-b). Sonraki Spike Dedektör üzerinde sağ tıklayın, “İşleme Ekle” ve “Patlama dedektörü” seçin ve pencere açılır içinde Tamam’ı tıklatın. “Dedektör patlama” (ısı) Muse simgenin altında görünecektir (tamamlayıcı şekil 3.3a-b). Sonraki patlama Dedektör üzerinde doğru tıkırtı, seçme “Eklemek işleme” ve “Sinir istatistikleri derleyici.” Pencere açılır, dosya üstbilgisi, de toplanan istatistikleri ve senkronizasyonu seçili olduğuna emin olun. Tamam’ı tıklatın. “İstatistikler derleyici”-ecek gözükmek altında (tamamlayıcı şekil 3.4a-b).Not: Bu adaptif eşik geçiş (6 x STD filtre), 100 ms arası spike aralıklarla sivri 5, 10 oranı algılama ateş demek en az sayıda ile ayarlar 20 ms bir senkronizasyonu parametrelerinin ve 0.083333 sivri min başına en az spike oranda s. Zamanlanmış kayıt kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms) için alt saat simgesine tıklayarak ayarlayın. Bu 5.1 dakikada kaydetmek ve 5 dakika boyunca kaydetmek için ayar bölümünde yer alan bilgileri değiştirerek elde edilir. Bu hemen başlatılır ve bir kez yürütülür (tamamlayıcı şekil 3.5). MEA sıcaklığı 37 ° C MEA taşımadan önce ulaştığını emin olun. MEA kuluçka makinesi kaldırmak, kayıt biriminde yer ve MEA kilitleyin. Ağ etkinlik başlangıç kayıt zamanlanmış kayıt bölümünde ya da “Dosyayı yürütmek” penceresinde kayıt simgesini tıklayarak kayıt işlemini başlatmak. 10 dakika daha uzun kayıtları elde edilebilir, ancak genellikle, bir kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms), yeterlidir. Kaydettikten sonra bana da kuluçka için dönmek.Not: MEA İnkübatör dışında zaman en aza indirmek için ve kısırlık korumak için özen göstermelidir. 4. veri analizi Çevrimdışı kayıt yazılımı kullanarak ham veri analizi yapılabilir. Dosya açılır menüsü tıklayın ve kayıt açık. Çözümlenmesi için ham veri dosyası seçin. Gerekli spiking parametreleri yakalamak için ham kayıtlar tekrarlanır. Sivri ortalama sayı elde etmek için Spike dedektörü modülü kullanmak ve senkronizasyonu dizini elde etmek için sinirsel istatistikleri derleyici modülü kullanmak. Spike dedektörü, patlama dedektörü ve istatistik derleyici modül olarak daha önce (Bölüm 3) yükleyin. Spike bulmak, patladı dedektörü ve istatistik derleyici modülü windows içinde aşağı açılır menülerden Spike listesi, ağ veri bloğu liste ve ölçümleri, Gelişmiş seçmenizi sağlar. Bir .csv dosyası yönettiği klasöründe oluşturur veri dosyası kaydetmeye başlamak için kayıt düğmesini tıklatın. Spike parametreleri – toplam sayısı sivri ve senkronizasyonu dizin – .csv dosyasında kaydedilir.Not: Bu işlemci zamanını ve hesaplama kaynaklarını tüketmek gibi gerçek zamanlı analiz ham veri kaydederken tavsiye edilmez.