내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

아래에 주어진 프로토콜 (초기) embryogenesis, 동안 BPA 노출의 효과 테스트를 표준화 하 고 BPS, BPF, 또는 병아리 배아 뉴런에서 다른 EDC와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 델라웨어 주립 대학의 제도적 정책 및 조류 배아에 대 한 NIH 정책 다음과 같습니다. 프로토콜은 DSU의 재료와 화학 안전 지침 확인입니다. 1. 소재 설정 1 m m 재고 솔루션 (10% 에타 놀의 mL 당 0.23 m g)을 물에 10%의 에탄올 (v/v)에서 BPA (m.w. 228.29)을 분해. Neurobasal 매체에 후속 희석 (0.1 µ M, 0.5 µ M, 1 µ M, 5 µ M 그리고 10 µ M)를 확인 합니다.주의: BPA는 환경 독 소 그리고 분말을 처리할 때 주의 행사 해야 합니다. 37 ° c.에 상용 탁상 계란 인큐베이터에서 병아리 알 품 어 E7 배아에 대 한 일 동안 알을 품 어. 3 ~ 4 h 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 측정 Sterilize MEAs의 필요한 수를 준비 하 고 세 번 약 10 mL BSLII 후드에 멸 균 증류수에 씻어.참고:는 MEAs는 8 x 8 표에 배열 64 성공 백 금 전극 포함. 전극 직경 30 µ m 이며, 전극 사이의 간격 200 µ m 이다. 로이 MEA의 부식으로 이어질 것입니다 MEAs는 살 균에 대 한 변성된 에탄올을 사용 하지 마십시오. (무 균 상태를 유지)에 뚜껑 살 균 컨테이너 내부 MEAs 장소 테이블 상단 인큐베이터로 이동. 55 ° c.에 적어도 6 시간 동안 구워 이 단계는 적절 한 살 균을 위해 중요 하 고 온도 60 ° c.를 초과 하지 않아야 합니다. 무 균 유지, 추가 사용까지 MEAs 스토리지에 대 한 BSLII 후드를 포함 하는 접시를 이동 합니다.참고: 우리는 플라스틱 뚜껑 오븐 안전한 유리 베이킹 접시 사용 하 고 표면 70% 에탄올과 건조에 대 한 BSLII 후드에서 소독. 약 수 엑스트라 세포 매트릭스 ECM 솔루션입니다. 밤새 4 ° C에서 유리병을 녹여 및 동결-20 ° c.에 100 µ L aliquots참고: ECM 냉동 배송입니다. ECM 해야 하지 주어질 실내 온도에 준비까지 코트와 실내 온도에 polymerizes, 그것 생산, 일단 코트 수는 없습니다. ECM 성장 인자 없이 알 수 없는 요인으로 인해 추가 효과 방지 하기 위해 선호 된다. 모든 해 부 악기 (Dumont #5 집게, 곡선된 겸 자, 작은 위, 및 봄이 위) 소독 자체 씰링 소재 70% 에탄올과 해 부 요리를 코팅 하 고 절 개 후드에 말리. 2. 병아리 배아 신경 문화와 네트워크 활동 도금의 날, 제거 된 유리병-20 ° C 냉동 고에서 ECM의 70% 에탄올 스프레이 얼음에. BSLII 후드 안쪽에 300 µ L 찬 neurobasal 매체를 추가 하 여 25% 희석. p 200를 사용 하 여 pipetteman을 터치 전극 표면에 박막을 떠나 즉시 제거 돌보는 MEA의 중심에 25 M 100 µ L를 추가 합니다. MEA를 커버 하 고 신경 세포를 접시에 준비까지 CO2 배양 기 (37 ° C, 5% CO2)에 배치. 70% 에탄올과 E7 달걀 (배아 7 일, 7 일 동안 37 ° C에서 incubated)의 외피를 소독. 감기 균 행 크의 균형 염 솔루션 (HBSS) 칼슘 없이 포함 된 Sylgard 하단 해 부 접시에 배아를 목을 벨. 눈 주위 고 눈알을 제거. 집게를 잘 몬 트 # 5를 사용 하 여 봄이 위 복 부에 절 개를 확인 하 고 개 및 광학 tectum 폭로 피부의 바깥 층을 제거. 껍질 하 고 신중 하 게 pial 멤브레인을 제거 합니다. 다른 페 트리 접시에는 개를 전송 하 고 봄이 위 약 2 m m의 작은 조각으로 잘라.참고: 거기 해서는 안됩니다 pial 막의 제거 후에 개에 연결 된 어떤 혈관. 비록 우리 악기와 해 부 지역 70% 에탄올으로 소독 철저 하 게은으로 절 개 후드 밖에 서 수행 하는 경우 상당히 좋은 결과 얻은 그것은 메 마른 절 개 후드, 해 부를 수행 하는 것이 좋습니다 가능한 경우, . 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여, 15 mL 원심 분리기 관으로 개 조각을 수집 하 고 제거 가능한 HBSS 개 싱크 분리기 튜브의 바닥의 조각을 시키는 후. 0.05%의 1 mL을 추가 트립 신/EDTA (37 ° C에 미리 예 열)와 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 조직 조각을 방해 하지 않고 트립 신을 제거 하 고 1 mL neurobasal 매체를 추가. 조직 싱크대 바닥에 조각 하 게 하 고 매체를 제거 합니다. 이 세척을 한 번 더 반복 합니다. 이 단계는 트립 신/EDTA를 씻어. Neurobasal 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 분쇄 시작. 분쇄는 메 마른 불 광택 파스퇴르 피 펫을 복용 하 고 그것을 통해 조직의 여러 번 통과 부드럽게 조직의 아니 더 많은 조각을 볼 수 있습니다 때까지 포함 한다. 어떤 부분이 반복된 패스 후 남아 있으면 그냥 두고 바닥에 정착.참고: 분쇄-거품은 형성 중지 하 고 열망 하 여 제거 하는 동안 볼만 하지 마십시오. Neurobasal 매체와 다시 중단된 셀 1시 10분 희석 하 고 Trypan Blue 염료와는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀. 믹스 50 µ L 희석된 셀의 0.5 mL 원심 분리기 튜브에서 Trypan 블루 솔루션의 50 µ L로. hemacytometer에는 coverslip에 배치 후 10 µ L을 추가 하 고 밝은 명확한 셀 (파란색 셀 죽 었 고 계산 한다).참고: 단일 E7 광섬유 tectum 범위 1와 5 x 107 셀/mL 사이에서 일반적인 셀 번호. 천연 접시 ECM에 세포 코팅 MEAs 2200 셀/평방 mm의 밀도. 우리의 나 시스템에 대 한이 MEA 당 약 130000 셀 변환 됩니다. 밤새 셀 첨부 파일 및 neurite 연장 (그림 1)에 대 한 CO2 인큐베이터에서 MEAs을 1 ml는 MEA에 볼륨을가지고 neurobasal 매체를 추가 합니다.참고: 다른 분야와 전극 숫자의 MEAs에 대 한 다른 셀 밀도 수 시도-일반적으로, 더 높은 세포 조밀도 결과 더 큰 네트워크 활동, 하지만 또한 짧은 살린된 문화. 다음 날, neurobasal 매체에 10 µ M의 최종 농도에 대우 MEA 단계 1.1에서에서 만든 1 m m 재고에서 BPA를 추가 합니다. 제어 MEA 물 (v/v) 솔루션에서 10% 에탄올의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 대체 보냈다 매체 neurobasal 매체 포함 10 µ M BPA 매일까지 7 일에서 생체 외에서 (7DIV) 그 후, 매일 네트워크 활동 증가.참고: 네트워크 활동 증가, 신진 대사 활동 증가 하 고 미디어 변경 내용을 더 자주 필요. 중간을 오렌지를 설정 하지 마십시오. 3. 신경 네트워크 활동을 기록 수집의 날, 신선한 neurobasal 매체와 문화 매체를 교환 하 고 녹음 하기 전에 2 h의 최소 CO2 배양 기에는 MEAs를 반환 합니다. 레코딩 소프트웨어를 시작 하 고 37 ° C에 온도 아이콘을 클릭 하 여는 MEA의 온도 설정 (보충 그림 3.1a-b).참고: 녹음 도금의 3 일 일찍 시작할 수 있습니다 및 문화 살아 있는 계속할 수 있습니다. (아래 왼쪽된 창 패널에서 스트림) “뮤 즈” 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 인수 매개 변수를 놓으십시오, “추가 처리” 및 “스파이크 탐지기”를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. “탐지기 스파이크 (6 x 표준)” 파일 이름 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.2a-b). 다음 스파이크 검출기에 오른쪽 클릭, “추가 처리” 및 “파열 탐지기”를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. “탐지기 버스트” (ISI) 뮤 즈 아이콘 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.3 a-b). 다음 버스트 검출기에 오른쪽 클릭, “추가 처리”와 “신경 통계 컴파일러.” 선택 팝업 창에서에서 파일 헤더, 잘 통계 집계 및 Synchrony 선택 되었는지 확인 합니다. 클릭 확인입니다. “통계 컴파일러” 아래에 표시 됩니다 (보충 그림 3.4 a-b).참고:이 적응형 임계값 (6 x 표준 필터), 5, 평균 발사 속도 감지 10에 스파이크의 최소한 100 ms에 간 스파이크 간격을 설정 합니다 synchrony 매개 변수 20 ms에서와 최소 스파이크 속도 분 당 0.083333 스파이크에서 s. 하단에 시계 아이콘을 클릭 하 여 녹음 시간 5 분 (300, 000 밀리초)에 대 한 예약된 녹화를 설정 합니다. 이 모든 5.1 분을 기록 하 고 5 분 동안 기록에 대 한 설정 섹션에서 정보를 변경 하 여 이루어집니다. 이 즉시 시작 될 것 이다 하 고 한 번 실행 될 것 이다 (보충 그림 3.5). MEA의 온도 MEA를 이동 하기 전에 37 ° C를 도달 했습니다 확인 하십시오. 인큐베이터에서는 MEA를 제거 하 고 기록 단위에 배치는 MEA를 잠글. 시작 예정 된 녹음 섹션에서 시작 레코드 또는 “파일 재생” 창에서 기록 아이콘을 클릭 하 여 네트워크 활동을 기록 합니다. 일반적으로, 5 분 (300, 000 밀리초)의 녹화 시간, 충분 하다 비록 더 이상 녹음 최대 10 분의 얻을 수 있습니다. 녹음 후 인큐베이터에는 MEA를 반환 합니다.참고: 합니다 주의 불 임을 유지 하 고는 MEA가 인큐베이터 밖에 시간을 최소화 합니다. 4. 데이터 분석 오프 라인 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터의 분석을 수행할 수 있습니다. 파일 풀 다운 메뉴 클릭 하 고 녹음을 엽니다. 원시 데이터 파일 분석을 선택 합니다. 필요한 급격히 매개 변수 캡처 원시 녹음 재생. 스파이크의 평균 수를 얻으려면 스파이크 검출기 모듈을 사용 하 고 Synchrony 인덱스를 얻기위한 신경 통계 컴파일러 모듈을 사용 합니다. 스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 (제 3) 하기 전에 통계 컴파일러 모듈 로드 합니다. 스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 통계 컴파일러 모듈 창 내에서 풀 다운 메뉴에서 스파이크 목록, 네트워크 버스트 목록 및 고급 통계, 각각 선택 합니다. 감독된 폴더에.csv 파일을 만듭니다 있는 데이터 파일을 기록 하려면 기록 단추를 클릭 합니다. 스파이크 매개 변수-스파이크와 Synchrony 인덱스의 총 수-.csv 파일에 기록 됩니다.참고:이 프로세서 시간과 컴퓨터 리소스를 사용할 수 원시 데이터를 기록 하는 동안 실시간으로 분석 권장 하지 않습니다.