ホルモン多電極アレイを用いた脊椎動物の神経回路網関数の開発化合物の影響の評価

下記プロトコル (初期) の胚発生に伴う BPA 暴露の影響をテストが標準化されて、BPS、BPF、またはひよこの萌芽期ニューロンの他の EDC を使用変更する場合があります。 このプロトコルは、デラウェア州立大学の制度政策と鳥類胚の NIH のポリシーに従います。また、プロトコルは DSU の材料と化学物質安全性ガイドラインの確認で。 1. 素材のセットアップ 1 mM 原液 (10% のエタノールのミリリットル当たり 0.23 mg) を作るために 10% のエタノール (v/v) で BPA (m. w. 228.29) を解散します。Neurobasal 媒体でその後希釈液 (0.1 μ M、0.5 μ M、1 μ M、5 μ M、10 μ M) を行います。注意: BPA は、環境の毒素および粉体を処理するときに注意が必要があります。 37 ° C で市販の卓上卵のインキュベーターでニワトリの卵を孵化します。E7 胚のため 7 日間卵を孵化させなさい。 3 に 4 h の 70% エタノールに浸漬して高さ定置滅菌 MEAs の必要な数を準備し、BSLII フードに滅菌水約 10 mL で 3 回すすぎ。注: 電極は、8 x 8 のグリッドに配置された 64 のナノ多孔質白金電極を含みます。電極径が 30 μ m と電極間隔が 200 μ m。MEA の腐食につながる電極を殺菌のため変性エタノールを使用しないでください。 (無菌状態を維持) にふた付け滅菌コンテナーの内部電極を配置し、テーブルの上のインキュベーターに移動します。55 ° C で少なくとも 6 時間焼くこの手順が適切な殺菌のため重要であり、温度は 60 ° C を超えないようにしてください。無菌性を維持し、さらに使用するまでストレージのための BSLII フードに Mea を含んでいる皿を移動します。注: 我々 はプラスチック製のふたでオーブン安全ガラスのグラタン皿を使用し、表面は 70% のエタノールと乾燥のための BSLII フードの場所でそれを殺菌します。 細胞外マトリックス ECM ソリューションの約数。4 ° C でバイアルを一晩解凍し、-20 ° C で 100 μ 因数を凍結注: ECM は冷凍で出荷されています。ECM 準備ができるまで [コートに室温で温めましたら、重合、一度コートに不可能だと部屋の温度にしないくるべきだった。成長因子なし ECM は未知の要因のための追加効果を防ぐために好まれる。 (デュモン #5 鉗子、カーブタイプ鉗子、ハサミ、春はさみ) すべての解剖器械を滅菌と自己シール材 70% エタノールを解剖皿のコーティングし郭清のフードで乾燥させます。 2. ひよこ萌芽期ニューロン文化とネットワーク活動 めっきの日、バイアルを削除-20 ° C のフリーザーから ECM の 70% エタノール スプレーし、氷の場所します。BSLII フード内 300 μ L 冷たい neurobasal 培地を追加することによって 25% に希釈します。 P200 を使用して pipetteman は、電極に触れるし、表面に薄い膜を残してすぐに削除するように注意して、MEA の中心に 25% の ECM の 100 μ L を追加します。MEA をカバーし、ニューロンをプレートに準備が整うまで CO2インキュベーター (37 ° C、5% CO2) に置きます。 E7 卵 (胚は日 7、37 ° C で 7 日間培養) の外殻を 70% エタノールで滅菌します。冷滅菌ハンクのバランスの取れた塩のソリューション (HBSS) カルシウムなしを含む Sylgard 底解剖皿に胎児の首をはねます。目の周りカット、目玉を取り外します。鉗子・ デュモン #5 を使用して罰金して前脳とファイバーの蓋を公開する皮膚の外側の層を削除春はさみ腹側に切開を行います。皮をむくし、軟膜を慎重に削除します。もう一つのシャーレに脳を転送し、春ハサミで約 2 mm の小さな断片にそれをカットします。注: が軟膜を除去した後、脳に接続されているすべての血管をしないでください。可能であればだが滅菌郭清のフードでは、解剖を行うことが好ましいがフード外郭清を実行すると、楽器と郭清範囲は徹底的に 70% のエタノールで滅菌されている限り、かなり良い結果を得た. 転送滅菌ピペットを使用して、15 mL 遠心管に前脳の部分を収集し、遠心管の底に前脳シンクの部分をさせることの後できるだけ多くできるだけ HBSS の削除します。 0.05 %1 mL を加えてトリプシン/EDTA (37 ° C に加温) 37 ° C で 15 分間インキュベートし、。 パスツール ピペットを使用して、慎重に組織の部分を乱すことがなくトリプシンを削除し、1 mL neurobasal 媒体を追加します。底にティッシュ シンクの作品を聞かせて、媒体を取り外します。この洗浄をもう一度繰り返します。この手順は、トリプシン/EDTA を洗浄することです。 Neurobasal 培地 2 mL を追加し、triturating を開始します。製粉は、滅菌ファイアーポリッシュ パスツール ピペットを取って渡すそれを介して組織数回優しくティッシュのないのより多くの部分を見るまで含まれます。繰り返しのパスの後に任意の部分が残っている場合、底に沈殿するがまま。注: は、triturating – 場合は泡が形成、停止および吸引により削除しながら泡を避けてください。 再浮遊細胞 1:10 neurobasal 媒体を希釈し、トリパン ブルー色素と診断を使用して実行可能なセルを数えます。トリパン ブルー溶液 0.5 mL 遠心管中の 50 μ L で希釈した細胞のミックス 50 μ。Coverslip 上に置いた後、血球に 10 μ L を追加し、明るい明確な細胞 (青色のセル死んでいるし、カウントすべきではない) を数えます。注: 1 と 5 x 107セル/mL の間単一の E7 こま範囲から典型的な細胞の数。 プレート、解離 ECM のセルは 2,200 セル/平方ミリメートルの密度で測定をコーティングします。これは、MEA 体制 MEA あたり約 130,000 セルにということを意味します。Neurobasal 培地 1 mL に、MEA のボリュームをもたらすと細胞接着や神経突起の伸展 (図 1) のために夜通し CO2インキュベーターで Mea を配置するを追加します。注: さまざまな分野、電極数の測定、異なるセル密度が試みたこと – 一般的には、細胞密度が高い大きいネットワーク活動の結果、また短い住まれていた文化に 。 次の日は、手順 1.1 処理 MEA に 1 mM の在庫から neurobasal 中 10 μ M の最終的な集中に BPA を追加します。対照 MEA、同じ量の 10% エタノール水溶液 (v/v) に追加します。 ネットワーク活動が増加すると 7 日間の in vitro (7DIV)、その後、毎日まで 10 μ M BPA 一日おきを含む neurobasal 培地で過ごした交換媒体。注: ネットワークの活動が大きくなる代謝活性を増加させるし、メディアの変更より頻繁にする必要があります。オレンジを回す媒体をてはいけないです。 3. 神経ネットワークの活動の記録 取得の日、新鮮な neurobasal 培地で培養液を交換し、録音の前に 2 時間の最小値のための CO2インキュベーターに電極を返します。録音ソフトウェアを起動し、温度のアイコンをクリックして、MEA の温度を 37 ° C に設定 (補足図 3.1a-b)。注: 録画めっきの 3 日目には早く始めることができますが、文化が生きている限り続けることができます。 (左のウィンドウ パネルの [ストリーム) の下の「ミューズ」アイコンを右クリックして集録パラメーターを設定「追加処理」と「スパイク検出器」を選択し、ポップアップ ウィンドウで [ok] をクリックします。「スパイク検出器 (6 x STD)”ファイル名の下に表示されます (補足図 3.2a-b)。 次スパイク検出器を右クリックして、「追加処理」と「バースト検出器」を選択し、ポップアップ ウィンドウで [ok] をクリックします。「バースト検出器」(ISI) はミューズのアイコンの下に表示されます (補足図 3.3a-b)。 次にバースト検出器を右クリックして、「追加処理」と「神経統計コンパイラ」を選択ポップアップ ウィンドウで、[ファイル ヘッダー、よく統計情報を集計および同期が選択されていることを確認します。[Ok] を。「統計コンパイラ」が下に表示されます (補足図 3. 4a-b)。注: これは適応的しきい値交差 (6 x STD フィルター)、5、平均発火率検出 10 スパイク数の最小 100 ms スパイク間隔を設定 20 ms で同期パラメーターとあたり最小 0.083333 スパイクで最小スパイク率 s。 下部に時計のアイコンをクリックして 5 分 (300,000 ミリ秒) の録音時間の予約録画を設定します。これは、5.1 分ごとを記録し、5 分間記録設定] セクション内の情報を変更することによって実現されます。これはすぐに開始されます、一度実行されます (補足図 3.5)。 MEA を移動する前に、MEA の温度が 37 ° C に達していることを確認します。インキュベーターから MEA を削除、記録ユニット上に配置し、MEA をロックします。ネットワーク アクティビティを予約録画セクションの開始レコードまたは「ファイルの再生」ウィンドウでレコードのアイコンをクリックしてして録音を開始します。通常、5 分 (300,000 ミリ秒) の録音時間は最大 10 分間のより長い録音を得ることができるが、十分です。 録音後、MEA をインキュベーターに戻ります。注: する必要があります注意無菌性を維持し、MEA はインキュベーター外時間を最小限に抑えます。 4. データ解析 生データの分析はオフライン記録ソフトウェアを使用して行うことができます。ファイルのプルダウン メニューをクリックし、録音を開きます。分析する生データ ファイルを選択します。必要なスパイキング パラメーターをキャプチャする生録音を再生します。 スパイクの平均数を取得し、スパイク検出器モジュールを使用して、同期のインデックスを取得するため神経統計コンパイラ モジュールを使います。 スパイク検出器、バースト検出器と統計コンパイラ モジュール (セクション 3) 前に、をロードします。 スパイク検出器、バースト検出器と統計コンパイラ モジュール ウィンドウ内にあるプルダウン メニューからそれぞれスパイク、ネットワーク バースト リスト、および高度な指標を選択します。 指示されたフォルダーで .csv ファイルを作成するデータ ファイルの録音を開始するレコードをクリックします。スパイク パラメーター スパイクおよび同調のインデックスの合計数は、.csv ファイルに記録されます。メモ: プロセッサ時間と計算資源を消費する可能性がありますこれと、raw データを記録しながら、リアルタイム解析は推奨されません。