Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden
概要
Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.
Abstract
BIZ-Phenole, wie BIZ-Phenol A (BPA) und BIZ-Phenol-S (BPS), sind Agenten am meisten benutzt in der Produktion von Kunststoffen und zahlreichen Produkten des täglichen Lebens dadurch. Sie werden als endokrine hormonhemmende Verbindungen (EDC) mit Estradiol-ähnliche Eigenschaften klassifiziert. Langfristiger Exposition gegenüber EDZ, selbst bei niedriger Dosierung wurde mit verschiedenen gesundheitlichen Mängel einschließlich Krebs, Verhaltensstörungen und Unfruchtbarkeit, mit größere Anfälligkeit Entwicklungsstörungen zu frühen Zeiten verbunden. Um die Auswirkungen von BPA auf die Entwicklung der neuronalen Funktion zu untersuchen, haben wir eine in-vitro- neuronalen Netzes abgeleitet aus dem frühen Küken embryonalen Gehirn als Vorbild verwendet. Wir fanden, dass die Exposition gegenüber BPA beeinflusst die Entwicklung der Netzwerkaktivität, speziell Spick Aktivität und Synchronisation. Eine Änderung der Netzwerk-Aktivität ist das entscheidende Bindeglied zwischen dem molekularen Ziel eines Medikamentes oder zusammengesetzte und seine Wirkung auf Verhaltensstörungen Ergebnis. Multi-Elektroden sind nützliche Werkzeuge, um die Auswirkungen von Drogen auf Netzwerk-Aktivität in VitroStudie zunehmend. Es gibt mehrere Systeme auf dem Markt und zwar gibt es Schwankungen in der Anzahl der Elektroden, die Art und Qualität der Elektroden-Array und Analysesoftware, die zugrunde liegenden Grundsätze und die Daten ist dasselbe über die verschiedene Systeme. Obwohl derzeit auf Analyse der zweidimensionalen in-vitro- Kulturen beschränkt, werden diese MEA-Systeme verbessert um in Vivo Netzwerkaktivität in Hirnschnitten zu ermöglichen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die embryonale Belichtung und Aufzeichnung von neuronalen Netzwerk-Aktivität und Synchronität sowie repräsentative Ergebnisse.
Introduction
4, 4 ‘-Isopropylidenediphenol, gemeinhin als Bisphenol-A oder BPA, Zusatzstoff Anti-Oxidationsmittel findet in einer Vielzahl von Polycarbonat und Epoxy Harz basierte Produkte reichen von Thermopapier, CDs und zertrümmern Beweis Glas auf der Innenseite der Beschichtung Getränkedosen. Obwohl BPA bekannt wurde, dass eine endokrine hormonhemmende Agent zu sein, der Östrogen1imitiert, haben Studien über die negativen Auswirkungen aufgrund der täglichen lässig Exposition gegenüber BPA vor allem in den letzten 10 – 15 Jahren kommen. Selbst geringe Mengen an BPA-Exposition folgen tiefsten in frühen Entwicklungs-Perioden, einschließlich in der Embryogenese durch Exposition von Müttern2,3. In Utero Belastung von weiblichen Embryonen mit endokriner Chemikalien hat auch mit erhöhter Krankheitsanfälligkeit von vaginalen Brust Krebs4,5verbunden worden. Tierstudien haben gezeigt, dass BPA-Exposition zu atypischen Gehirnstruktur und funktionellen Abnormitäten manifestiert sich in Verhalten6führt. Infolgedessen hat die Verwendung von BPA in kleinen Fläschchen durch die Zulassungsbehörden in Europa und Nordamerika, darunter der FDA verboten. Zur Einhaltung der Vorschriften haben viele Hersteller auf 4, 4′-Sulfonyldiphenol oder Bisphenol-S (BPS) umgestellt. Dass BPA und BPS sind strukturelle Analoga und, dass die jüngsten Berichte vergleichbare Wirksamkeit der BPS in Östrogene Transkription7 zeigten, ist es wichtig, die Toxizität dieser zusammengesetzten verwandten BPA zu studieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von BPA (und andere endokrine Disruptoren) auf Netzwerken von Neuronen, die mit einem Wirbeltier-Modell, die Küken-Embryos zu testen. In-vitro- Kulturen von Neuronen bilden synaptischen Kontakte und generieren Aktionspotentiale (Spikes auch genannt). Die spiking Aktivität dieser Kulturen kann mit Multi-Elektroden-Array (MEA) Systemen erfasst werden. Spitzen werden als synchron sein, wenn sie innerhalb von 5 ms voneinander auftreten. Erste zufällige spiking Aktivität, die schließlich synchronisiert ist ein wesentliches Merkmal der Entwicklung neuronaler Netzwerke8,9. Synchronität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden und mehrere Algorithmen werden in der Literatur9,10,11beschrieben. In unseren Analysen verwenden wir einen Algorithmus entwickelt von Paiva und Mitarbeiter12 die Recording-Software integriert ist, das MEA-Erfassungssystem treibt. Die robuste spiking Aktivität embryonalen Küken Neuronen bietet einen Prototyp für die Untersuchung der Wirkung von BPA auf neuronale Aktivität13. Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays zu Rekord spiking Aktivität haben wir beobachtet, dass BPA-Exposition die Entwicklung von neuronalen spiking Synchronität9,14 hemmt. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für BPA-Exposition auf die Küken Embryos Neuronen in der Kultur sowie repräsentative Ergebnisse über die Entwicklung der neuronalen spiking Synchronität in Küken embryonalen Kulturen zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Phasen des schnellen Wachstums und Entwicklung z. B. Embryogenese sind besonders anfällig für die nachteiligen Auswirkungen der verschiedenen endokrinen Störung Verbindungen einschließlich BPA. Wir bieten ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Auswirkungen von BPA-Exposition in einem in Vitro vertebrate neuronalen Netzwerk-Modell. Unter Verwendung dieses Protokolls, festgestellt wir, dass BPA die spikerate sowie die Synchronität Index in der Entwicklung neuronaler Netzwerke (Abbildung 2a-b senkt).
Unsere Methodik wurde entwickelt, um die BPA-Exposition in der frühen Embryogenese studieren und kann leicht angepasst werden, um die Untersuchung der Auswirkungen von anderen EDZ. Embryonale neuronale Kulturen aus der Küken sind relativ leicht zu schaffen im Vergleich zu anderen vertebrate Modelle, darunter auch die Ratte oder Maus. Darüber hinaus gibt es keine Notwendigkeit, eine separate tierraum – ein einfache Inkubator auf einem Labortisch ist ausreichend, um diese Tests durchzuführen. Wir beschreiben die Verwendung eines Multi-Elektroden-Systems (MEA) für die Beurteilung der Wirkung von EDC, BPA, auf Netzwerk-Aktivität. Die hier beschriebenen Protokolle können mit anderen Systemen angewendet werden. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Sterilität. Dazu gehören Dissektion des Embryos unter sterilen Bedingungen – Sterilisation von Instrumenten mit 70 % Ethanol und sterile Hank ausgewogen Salze Lösung ist ausreichend. Da die Daten über einen Zeitraum von Wochen gesammelt werden, ist es wichtig, sterile Handhabung der MEAs pflegen. Die neuronalen Kulturen einmal etabliert können gezüchtet werden langfristig – bis zu drei Monaten – und eignen sich somit für das Studium Langzeitexposition gegenüber EDZ und anderen Verbindungen auf neuronale Vernetzung. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Zeit zwischen Präparation und Beschichtung. Der optimale Zeitpunkt ist 30 min, einschließlich die Inkubation des Gewebes mit Trypsin. Je länger die Zeit, desto schlechtere das Überleben der Zellen.
Wir beschreiben hier ein einfachen Protokolls, das angewendet werden kann, für die Beurteilung von chemischen oder Medikament, das Verhalten und die neuronale Funktion auswirkt. Hier haben wir eine Zelldichte von 2.200 Zellen pro mm2verwendet; Allerdings kann dies geändert werden und andere Zelldichten eingesetzt werden. Im Allgemeinen haben wir festgestellt, dass Zelldichte Netzwerkaktivität – mehr Spikes in kürzerer Zeit erhöht. Die Methode hat beschrieben, obwohl sehr nützlich bei der Beurteilung der Auswirkungen von Chemikalien auf Netzwerk-Aktivität Einschränkungen. Eine der größten Einschränkungen der Methode ist, dass diese in-vitro-Kulturen zweidimensional die dreidimensionale Architektur des vertebrate Gehirns nicht wiedergibt. Dies kann mithilfe von Slice-Aufnahmen überwunden werden. Eine weitere Alternative bedeutet für die Behandlungen auf sich entwickelnden Küken-Embryos durch Anwenden eines kleinen Fensters Schneiden am breiten Ende des Ei-15, sezieren das Gehirn am Ende der Therapie, dicke Schichten auf eine Vibratome zu machen und setzen auf die MEA für Aufnahme-Netzwerk-Aktivität.
Unser Protokoll gilt, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von endokrine Disruptoren auf die Entwicklung von Netzwerk-Aktivität und die Erforschung einer mechanistischen Basis für die Auswirkungen dieser Chemikalien bietet.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie stützt sich auf die NSF (HBCU-UP-Forschungspreis der Initiation, HRD 1401426 und EPSCoR EPS-0814251) und NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.s. wird unterstützt durch ein Stipendium von der Delaware INBRE III 6404.
Materials
| #5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
| Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
| HBSS | Fisher | 14170112 | |
| Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
| Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
| Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
| Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
| Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |
参考文献
- Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).
- Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).
- Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).
- Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
- Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).
- Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups’ reproductive system. Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).
- Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).
- Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).
- Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).
- Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).
- Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12 (7), 1006223 (2016).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5 (12), 14443 (2010).
- Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).
- Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).
- Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).
- Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
- Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).
