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Abstract
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Protocol
結果
Discussion
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行動学

Una connessione Wireless, interfaccia bidirezionale per registrazione In Vivo e la stimolazione dell'attività neurale a comportarsi liberamente ratti

Published: November 07, 2017
doi:
10.3791/56299
, , , , , , , ,
1Behavioral Neuroscience, Experimental and Biological Psychology,Philipps-Universität Marburg, 2Behavioral Neurosciences Institute (INeC), 3Thomas RECORDING GmbH, 4Department of Neurophysics,Philipps-Universität Marburg

概要

Una connessione wireless, sistema bidirezionale per registrazioni neurale multicanale e stimolazione a comportarsi liberamente ratti è stato introdotto. Il sistema è leggero e compatto, avendo così un impatto minimo sul repertorio del comportamento umano. Inoltre, questo sistema bidirezionale fornisce un sofisticato strumento per valutare le relazioni causali tra pattern di attivazione del cervello e comportamento.

Abstract

In vivo elettrofisiologia è una tecnica potente per studiare la relazione tra attività cerebrale e comportamento in un millisecondo e micrometro scala. Tuttavia, gli attuali metodi per lo più si basano su registrazioni di cavo legato o utilizzano solo sistemi unidirezionali, permettendo la registrazione o la stimolazione dell’attività neurale, ma non allo stesso tempo o stesso bersaglio. Qui, un nuovo wireless, il dispositivo bidirezionale per registrazione multicanale simultanea e la stimolazione dell’attività neurale a comportarsi liberamente ratti è descritto. Il sistema opera attraverso una singola fase di testa portatile che trasmette attività registrate e possa essere mirata Real-Time per stimolazione del cervello utilizzando un software multicanale basato su telemetria. La fase di testa è dotata di un preamplificatore e una batteria ricaricabile, che permette registrazioni a lungo termine stabile o stimolazione per fino a 1 h. d’importanza, la fase testa è compatta, pesa 12 g (batteria inclusa) e quindi ha un impatto minimo sull’umano repertorio comportamentale, rendere il metodo applicabile a una vasta serie di attività comportamentali. Inoltre, il metodo ha il vantaggio che l’effetto di stimolazione del cervello sull’attività neurale e il comportamento possa essere misurato simultaneamente, fornendo uno strumento per valutare i rapporti causali tra pattern di attivazione specifiche del cervello e comportamento. Questa caratteristica rende il metodo particolarmente prezioso per il campo di stimolazione cerebrale profonda, permettendo la valutazione precisa, il monitoraggio e la regolazione dei parametri di stimolazione durante gli esperimenti comportamentali a lungo termine. L’applicabilità del sistema è stato convalidato utilizzando il colliculus inferiore come una struttura del modello.

Introduction

Una questione fondamentale in neuroscienza è attività come elettrica nei circuiti neurali definiti genera alcune forme di comportamento. In vivo elettrofisiologia è una tecnica potente per affrontare questa domanda, fornendo uno strumento per registrare o stimolare attività elettrica nel cervello, mentre animali eseguono determinate attività comportamentali. Tuttavia, gli attuali sistemi affidano frequentemente cavo legato registrazioni1,2, probabilmente ridurre la mobilità e prevenire la piena espressione del repertorio comportamentale umano. Inoltre, per la maggior parte unidirezionale sistemi sono usati, permettendo sia registrazione3,4,5 o stimolazione6,7 di attività neurale, ma non allo stesso tempo o stesso bersaglio, rendendo difficile distinguere le relazioni causali tra pattern di attivazione specifiche del cervello e comportamento. Solo pochi wireless, sistemi bidirezionali per le preparazioni di in vivo sono attualmente disponibili. Tuttavia, essi sono solitamente pesante (40-50 g) e sono composti da due distinte unità portatile, cioè una fase testa e uno zaino collegato per alimentazione basata su batteria alimentazione8,9,10, rendendoli meno flessibile e aumentando il rischio di scollegamento del cavo per esempio durante la self-toelettatura comportamento. Nessuno dei suddetti sistemi wireless offrono impiantabili microelettrodo unità per acquisire un concetto integrato completo dell’attività neurale durante l’intero comportamento etologico valido con alta riproducibilità delle condizioni sperimentali.

Qui, è stato introdotto un nuovo wireless, il dispositivo bidirezionale per registrazioni in vivo e la stimolazione dell’attività neurale a comportarsi liberamente ratti. Il sistema Wireless di Thomas (TWS) opera attraverso un rimovibile testa monostadio che può trasmettere un’attività multicanale con fino a quattro canali di registrazione indipendente e può essere mirata per la stimolazione elettrica del cervello in tempo reale. Inoltre, un’unità di microelettrodi cronicamente impiantabili compatibile con TWS è stata sviluppata che permette la registrazione e stimolazione neurale. Un’interfaccia utente grafica del software TWS, per registrazione e stimolazione inoltre è presentata. Questo studio descrive l’implementazione di convalida e in vivo dell’intero dispositivo.

Al fine di convalidare il sistema TWS colliculus inferiore è stato scelto come una struttura neurale di destinazione perché un’evidente risposta comportamentale può essere suscitata dalla sua stimolazione elettrica. È ampiamente noto che la stimolazione elettrica del colliculus inferiore suscita incondizionate ‘paura-come’ le risposte comportamentali in ratti, come vigilanza, posture lateralmente, inarcando la schiena, congelamento e il comportamento di fuga (volo). Questo modello di risposta imita le reazioni alla paura evocati dalle sfide ambientali, quali un evento dannoso percepita, attacco o minaccia alla sopravvivenza11,12,13. È stato presupposto che l’essere in grado di suscitare tale comportamento chiaro ed inequivocabile fornirebbe una vera sfida per TWS.

Protocol

tutti i protocolli e gli esperimenti erano in conformità con le attuali linee guida europee (2010/63/UE) e approvato dalle autorità regionali (Regierungspräsidium Gießen, MR 20/35 Nr.25/2015). 1. animali House maschi ratti adulti di Wistar (200-250 g) in gruppi di 3-4 in condizioni standard di laboratorio per almeno una settimana prima dell’intervento chirurgico per consentire acclimatazione. Due giorni dopo la chirurgia, ratti di casa a coppie. Copertura singole gabbie con coperchi acrilici ad alte. Evitare convenzionale coperchi fatta di griglia del metallo, poiché gli impianti possono rimanere incastrati, aumentando il rischio che diventano danneggiato e/o instabile nel corso tempo. 2. La chirurgia stereotassica prima di iniziare l’intervento chirurgico, organizzare e preparare le attrezzature e i materiali seguenti: ottenere apparecchiature chirurgiche sterili composto forbici sterili, forcipe smussato-fine, spatole, chirurgiche Clippers, trapano odontoiatrico e cotone boccioli. ottenere farmaci e sostanze chimiche tra cui xylocaine, isoflurano, povidone iodio e 70% di etanolo, tramadolo cloridrato, salve occhio dexpantenol, perossido di idrogeno 3%. Ottenere materiale di fissaggio comprese viti in acciaio inox, resina acrilica, colla ultravioletta e tappo protettore. Ottenere un’unità microelettrodo, composta da (i) un singolo elettrodo di registrazione (vetro di quarzo isolato microelettrodo di tungsteno platino, con forma della punta conica, diametro esterno: 80 µm, punta conica, impedenza a 1 kHz: 500 kOhm) o un tetrodo (vetro di quarzo coibentato microelettrodo di platino/tungsteno 4 core, diametro esterno: 100 µm, punta conica, impedenza a 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) un elettrodo di stimolazione (filo di platino/iridio (platino 90%, 10% Iridio), core diametro 125 µm, diametro esterno 150 µm, impedenza < 10 kOhm) collegata a una piastra di contatto e (iii) un elettrodo di riferimento di filo di platino (diametro dell’albero, 100 µm; Figura 1A). Ottenere portaelettrodo incollato con colla solubile in acqua all’unità microelettrodo e testato per la funzionalità almeno 2 h in anticipo ( Figura 1B). Ottenere un convenzionale sistema tethered composto da un preamplificatore differenziale, un amplificatore principale e un passa-banda filtro amplificatore per le registrazioni. Ottenere materiale aggiuntivo, come guanti, riscaldamento pad, siringhe e fisiologica. Ottenere casa gabbie (L x W x h: 42 cm x 26 cm x 38 cm). Procedura Nota: l’impianto dell’elettrodo viene eseguito durante una chirurgia stereotassica convenzionale nell’ambito dell’anestesia isoflurano. Garantire che lo sperimentatore è indossare guanti, mascherina chirurgica e camice da laboratorio. Iniziare mettendo l’animale in una camera di induzione di anestesia (isoflurano 4-5%, flusso di ossigeno 1 L/min, durata ~ 5 min). Test per la perdita di riflessi (punta e coda riflessi) con il forcipe per confermare l’anestesia profonda. Collocare la testa dell’animale in una maschera di anestesia fissata attorno al bar incisivo superiore della cornice stereotassica e regolare anestesia (isoflurano 2-3%, flusso di ossigeno 0,7-0,8 L/min). Difficoltà e allineare orizzontalmente l’animale ' la testa nell’apparato stereotactic usando orecchio bar e bar incisivo superiore Radere il campo chirurgico utilizzando clippers chirurgica o una forbice e sterilizzare con povidone iodio. Metti l’animale su un rilievo di riscaldamento per prevenire l’ipotermia e curare gli occhi con dexpantenol pomata di occhio per impedire loro di essiccazione. Iniettare xylocaine (0.3-0.4 mL, per via sottocutanea, s.c.) al centro del campo chirurgico. Test per la perdita dei riflessi ancora. Fare una piccola incisione (1,5 cm) con un bisturi nel mezzo del campo chirurgico per esporre il cranio. Separare la pelle delicatamente e rimuovere il tessuto residuo utilizzando pinze, forbici e spatola. Pulire accuratamente il cranio utilizzando bastoncini di cotone rivestita con perossido di idrogeno. Trapano 4-5 piccoli fori (4,7 mm) nel cranio per il fissaggio delle viti in acciaio inox. Collegare unità/pinza porta elettrodo microelettrodo al preamplificatore e per il micromanipolatore stereotassica ( Figura 1B e 1C). Praticare un foro (circa 7 mm) nel cranio sopra l’area di destinazione utilizzando le coordinate da un Atlante del cervello secondo l’animale utilizzato. Nello studio presente, posizionare le punte dell’elettrodo ha puntate il colliculus inferiore utilizzando le seguenti coordinate, con il bregma che serve come riferimento: anteriore/posteriore, − 8,8 mm; mediale/laterale, 1,5 mm; e dorso/ventrale, 3,5 mm 14. Assorbire qualsiasi sangue con cotton fioc. Introdurre verticalmente l’unità microelettrodo, fino a quando le punte dell’elettrodo raggiungere l’area di destinazione. Posizionare il cavo di terra lungo le viti in acciaio inox e sotto la pelle. Monitor attività di spike e attentamente regolare posizionamento degli elettrodi con micromanipolatore fino a raggiungere una zona di neuroni attivi nella struttura di destinazione e rilevare attività neurale con un rapporto segnale-rumore, adatto per l’ordinamento di spike. Fissare l’unità microelettrodo al cranio con colla ultravioletta e coprire la piastra di contatto e viti con resina acrilica. Iniettare soluzione fisiologica (mL 1 i.p.) e tramadolo (25 mg/kg, s.c.) per prevenire la disidratazione e garantire l’analgesia post-operatoria, rispettivamente. Scollegare l’unità microelettrodo dalla pinza porta elettrodo con un pennello imbevuto di acqua. Stop anestesia, rimuovere con cautela il ratto dalla cornice stereotassica. Staccare il preamplificatore del microelettrodo unità Collegare il cappuccio di protezione sull’unità di microelettrodi impiantati e scollegarlo solo durante le procedure sperimentali. Tenere gli animali in coppia nella casa-gabbia dal secondo giorno dopo l’intervento chirurgico. Comportamento di animali monitor al giorno per l’infezione della ferita possibile, peso corporeo, stato di salute e generali per un periodo di 7 giorni dopo la chirurgia. Dopo questo periodo di recupero, eseguire in vivo elettrofisiologia ed esperimenti comportamentali. Nota: La procedura chirurgica ha una durata compresa tra 60-90 min. Durante la chirurgia, tail flick riflessi devono essere continuamente monitorati e regolato, anestesia, se necessario. 3. In Vivo Elettrofisiologia attrezzature e procedura Nota: registrazioni elettrofisiologiche e lo stimolo sono effettuati utilizzando il TWS. Ottenere una fase testa con un preamplificatore integrato e la batteria collegata (registrazione quattro canali; intervallo di input di registrazione analogica: 0-12 mV pk-pk; stimolazione output: ±625 µA; L x W x h: 24 x 22 x 12 mm; Peso: 6 g senza batteria, 12 g con batteria; Scaricamento della batteria tempo fino a 1 h). Questa fase testa è idonea ad essere collegata direttamente all’unità di microelettrodi impiantati tramite un connettore multipolare in miniatura ( Figura 2). Ottenere una batteria (accumulatore agli ioni di litio, 3.7-4.2 V DC, 230 mAh, 27 x 20 mm x 6 mm, tempo di funzionamento di 1 h) montato sopra la fase testa ( Figura 2). Se necessario utilizzare sostituzione batteria ricaricabile con capacità di 450 mA per circa 2,5 ore di funzionamento. Assicurarsi che una luce verde si accende in fase di testa mentre la batteria è collegata all’it. Ottenere un ricetrasmettitore (ricevitore-trasmettitore) collegato ad un personal computer tramite porta USB standard e permette il funzionamento senza fili per fino a 5 m ( Figura 2E). Ottenere un personal computer con software TWS per stimolazione elettrica e la registrazione dell’attività neurale ( Figura 3 e Figura 4 ). Ottenere un preamplificatore tethered e un sistema di acquisizione dati utilizzato durante la chirurgia (Vedi punto 2.1.5) per le registrazioni e un generatore di stimolo per la stimolazione, al fine di confrontare l’efficacia di TWS in svegli i ratti una settimana dopo l’intervento chirurgico. Nota: La stimolazione elettrica è fornita e attività extracellulare da singoli neuroni è registrata dalla stessa unità microelettrodo impiantato utilizzando entrambi i sistemi. I parametri di stimolazione (intensità di corrente, impulso e frequenza) devono essere regolati per ogni animale secondo la regione del cervello mirata. Nello studio presente, un 150-250 µA, 2500 Hz corrente è stato utilizzato per stimolare il colliculus inferiore. Comportamentale dosaggi Nota: una volta che nessuna barriera metallica è stato introdotto tra il ricetrasmettitore e la fase testa animale, TWS è applicabile a una vasta serie di attività comportamentali. Come esemplare test comportamentali, è stato usato in campo aperto per misurazione di attività comportamentale generale e l’elevato e labirinto, un test standard per valutare il comportamento del tipo di ansia in roditori 15. Una videocamera era posizionata centralmente sopra campo aperto ed elevata plus maze per registrazioni comportamentali. Prima del test comportamentali, gestire ogni animale per tre giorni consecutivi (5 min ogni giorno). Prima di ogni periodo di gestione è possibile collegare la fase testa con batteria all’unità microelettrodo precedentemente impiantati. Non eseguire alcuna registrazione o stimolazione durante la manipolazione. Campo posto il ratto nel centro del campo aperto (40 x 40 cm x 40 cm; rosso luce ~ 30 Lux) e permettono di esplorare l’apparecchio per almeno 5 min sotto registrazione neurali. Determinare la soglia di fuga – intensità di corrente minima produzione di corsa o il salto. Nello studio presente, fornire una stimolazione di 2500 Hz ad alta frequenza (larghezza di impulso: 100 µs; intervallo di impulso: 100 µs) per il colliculus inferiore a intervalli di 1 min aumentando l’intensità di corrente di 20-50 µA passaggi fino a quando i ratti hanno mostrato sfuggire comportamento. Tornare ratto alla sua gabbia a casa, pulire il campo aperto (0,1% soluzione di acido acetico) e asciugare it. Nota: Al fine di confrontare l’efficacia di stimolazione di TWS con il tradizionale sistema legato la procedura sopra descritta è stata eseguita utilizzando entrambi i sistemi. Elevati plus labirinto Nota: il più-labirinto utilizzato in questi esperimenti era fatta di acrilico grigio e consisteva di due braccia aperte (50 cm lunghezza x larghezza 10 cm) e due chiusi braccia (50 cm lunghezza x 10 cm di larghezza, con pareti alte 40 cm) che esteso da una centrale pla TForm elevata 50 cm sopra il piano 16. Posto il ratto nel centro del lato più-labirinto verso un braccio aperto e permettono di esplorare liberamente l’apparato sotto registrazione costante durante 5 min. Registrare il numero di voci in, e il tempo trascorso tra le braccia aperte e chiuse per un periodo di 5 min. Restituire il topo a sua gabbia a casa, pulito (0,1% soluzione di acido acetico) e asciugare il labirinto prima di ogni test. Perfusione e istologia anestetizzare il topo con xilazina/ketamina (150 mg/kg e 100 mg/kg, rispettivamente; i.p.). Collegare l’unità elettrodo impiantato al cavo di stimolazione e applicare la stimolazione elettrica (corrente intensità 50 µA, larghezza di impulso: 100 µs; intervallo di impulso: 100 µs) durante 90 s al fine di produrre una piccola lesione intorno alla punta dell’elettrodo. Scollegare il cavo di stimolazione e irrorare l’animale attraverso il ventricolo sinistro con fisiologica seguita da 200 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato di sodio 0.1 M, pH 7,3 (per una descrizione dettagliata, vedere riferimento 17 ). Rimuovere il cervello e immergerlo per 4 h in fissativo fresco a 4 ° C. Assicurarsi che la temperatura della camera del criostato principale è a -20 ° C. Congelare il cervello su ghiaccio secco e tagliarle a 50 µm seriale sezioni coronali utilizzando un criostato. Macchia le sezioni con cresylviolet al fine di individuare le posizioni delle punte dell’elettrodo, secondo l’Atlante di Paxinos e Watson 14.

Representative Results

Dati tecnici TWS Il sistema wireless offre 4 canali di registrazione indipendente e canale 1 stimolazione. Attività extracellulare era prelevati dall’elettrodo di registrazione singolo core e trasmessi all’ingresso del segnale ad alta impedenza del sistema wireless. Il segnale registrato era (x200) pre-amplificato da un preamplificatore di ingresso differenziale, accoppiamento AC e filtrata passa banda (banda del segnale fisso, 500 Hz… 5 kHz) per registrare solo multi-unità attività, perché nello studio presente l’interesse principale era quello di attività dell’unità di registrazione e potenziali di campo non locale. Il principale-amplificatore a guadagno programmabile integrato offre guadagno software-regolabile per i quattro canali di registrazione (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). La catena di segnale completo del sistema wireless offerto valori di guadagno complessivo di x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 e x12800. Dopo di filtro e di amplificazione, il segnale analogico è stato digitalizzato da un convertitore analogico-digitale, modulato su un elemento portante ad alta frequenza e trasmesso da un ricetrasmettitore radio utilizza la banda ISM a 2.4-2.5 GHz. Sul lato opposto del percorso di trasmissione è stato utilizzato lo stesso tipo di ricetrasmettitore. Questo secondo ricetrasmettitore è stato collegato ad un personal computer tramite una porta USB. Il percorso di trasmissione è stato utilizzato per la trasmissione dati bi-direzionale per inviare segnali extracellulari registrati dall’animale al computer e viceversa i parametri di controllo per l’amplificazione del segnale e stimolazione dal computer all’animale. Utilizzando il TWS, era possibile registrare l’attività cerebrale di multi-unit e modificare il comportamento dell’animale stimolando il collicolo inferiore, mentre il topo si muoveva liberamente in campo aperto con successo. Il ricetrasmettitore è stato disposto fino a 5 metri dall’animale ed è stato collegato al computer tramite un USB porta (vedere Figura 2). Un confronto tra la qualità del segnale registrato ha reso con il legato e il sistema wireless è dimostrato nella Figura 5. TWS registra attività multi-unit con una qualità di segnale simile come un sistema di registrazione via cavo. Il micro-stimolatore è un vero stimolatore wireless che aggiorna i parametri di stimolazione in tempo reale, cioè il segnale di stimolazione, i cui parametri sono definiti con il software TWS è passato all’elettrodo di stimolazione collegato alla fase testa all’interno di alcuni millisecondi dopo aver premuto il pulsante di stimolazione. Di conseguenza, era possibile cambiare i parametri di stimolazione senza prendere l’animale fuori dalla gabbia. Questa caratteristica ha il vantaggio che uno può ridurre al minimo il tempo per gli esperimenti di stimolazione. Un software TWS è stato appositamente progettato per consentire il controllo di tutte le funzionalità del sistema wireless (es. registrazione e stimolazione) tramite una interfaccia grafica (Figura 3 e Figura 4). Per la micro-stimolazione, è stato utilizzato un segnale di stimolazione che è stato sviluppato utilizzando l’interfaccia utente grafica del software TWS. Lo stimolatore di TWS è stato usato in una modalità di equilibrata stimolazione costante-corrente di carica. Il pattern di stimolazione è stato inviato in modalità wireless per lo stimolatore di corrente costante integrato nell’unità wireless fase testa. Corrente di stimolazione è stata applicata tra un microelettrodo di lavoro inserito nel target di interesse (come per esempio il colliculus inferiore nello studio presente) e una più grande controelettrodo distante che è servito come l’elettrodo di terra o riferimento di TWS. Secondo l’impedenza degli elettrodi di stimolazione ed il rispetto di tensione dello stimolatore costante-corrente, è possibile utilizzare una gamma corrente di stimolazione massima di ±625 µA, anche se è stata richiesta una soglia molto bassa corrente negli esperimenti attuali. Qui, bifase carica equilibrata stimolazione costante-corrente è stata utilizzata con correnti di picco fino a 300 µA. In caso di stimolazione bifase, il primo impulso è utilizzato per suscitare l’effetto fisiologico e il secondo impulso inverte solitamente processi elettrochimici che si verificano durante la stimolazione impulsi18. La fase di testa TWS fornisce tempo reale pattern di stimolazione impostata tramite l’interfaccia utente grafica del software TWS (Vedi Figura 4). Il software TWS è diviso in tre sezioni principali: un (i) finestra principale con controlli per registrazione e stimolazione, una finestra di generatore (ii) stimolo con tutte le opzioni di impostazione per i parametri del segnale di stimolazione e una finestra (iii) riproduttore per riprodurre il file di dati registrati. La finestra principale consente all’utente di visualizzare i segnali registrati di fino a 4 canali di registrazione, impostare il guadagno per tutti i canali e avvio/arresto della registrazione dei segnali visualizzati. I dati del segnale vengono memorizzati in un file sul disco rigido del computer. Il percorso del file è impostato nel menu di configurazione. Oltre i parametri di registrazione, la finestra principale permette di avviare e arrestare il processo di stimolazione. La corrente di stimolazione costante che è passata attraverso l’elettrodo di stimolazione nel cervello degli animali viene visualizzata in tempo reale sullo schermo della finestra principale. I parametri del segnale di stimolazione sono preregolati nella finestra delle impostazioni del parametro di stimolo. È possibile definire mono – o bifasico treni di impulsi di stimolazione e per impostare tutte le stimolazioni comunemente utilizzate parametri di impulso come ad esempio la larghezza, ampiezza di impulso, di impulso tempo tra gli impulsi, ecc (per dettagli Vedi Figura 4). La funzione di impulso di stimolazione che deriva dai valori parametri preselezionati è mostrata in un display grafico nella finestra del generatore di stimolazione. Il software TWS è stato progettato secondo gli aspetti di usabilità. L’usabilità del software è un fattore essenziale per garantire il corretto svolgimento dell’esperimento wireless stimolazione/registrazione e un ambiente di lavoro sicuro e confortevole. Aiuta anche a migliorare la riproducibilità dell’esperimento. Unità singola registrazione dati e stimolazione elettrica Extracellulare multi-unità attività fu successivamente registrato nel colliculus inferiore dallo stesso elettrodo impiantato utilizzando TWS e un sistema di registrazione tethered convenzionale. La figura 5 Mostra rappresentativi dati raw registrati usando entrambi i sistemi, mentre l’animale è stato liberamente commovente in un campo aperto. Confronto diretto dei segnali suggerisce simili forme d’onda di picco e livelli di rumore (Figura 5A e 5B). Una dimostrazione del modulo spike è raffigurata nella A ‘e B’. Dal momento che i ratti non hanno tentato di rimuovere la fase testa TWS dopo chirurgia e durante i giorni successivi, è stato presupposto che non interferisce in modo significativo con i loro movimenti e non ha causato disagio. Così, utilizzando TWS, un problema comune in tethered registrazioni dei ratti è stato evitato come rimozione e masticazione dei connettori e dei cavi. Infatti, i ratti con la tappa di testa TWS erano in grado di esplorare il campo aperto e più labirinto (sEE Movie 1) incroci normale espositrici, allevamento e governare i comportamenti. Inoltre, i parametri di stimolazione utilizzati con il convenzionale sistema tethered o TWS evocato lo stesso risultato del comportamento, comportamento di fuga qui. A partire da 100 µA, l’ampiezza corrente di stimolazione è stata aumentata gradualmente fino a quando è stata raggiunta la soglia di fuga – intensità di corrente minima produzione di corsa o il salto – e il comportamento di fuga è stato tratto. Le soglie di fuga individuale dei 4 ratti erano simili quando si utilizzano entrambi i sistemi (Figura 5). Figura 1: Microelettrodo TWS unità (1) registrazione singolo elettrodo/tetrodo, elettrodo di stimolazione (2), bordo di collegamento della fibra (3) elettrodo, cavi di collegamento (4) flessibile, filo di terra (5), (6) Connettore piastra, (7) maschio o femmina connettore per TWS sistema (A); TWS microelettrodo unità collegata al preamplificatore (8) e il titolare (9); (B) pronto per essere attaccato a una cornice stereotassica (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Vista superiore della fase testa TWS montato modulo (A) senza alimentazione dell’accumulatore. Dimensioni di massimo ingombro: altezza 12,5 m, profondità 24 mm (19,3 mm + 4,7 mm), Larghezza 22,1 mm, peso: 5.96 vista inferiore g. (B) risultati connettore dell’unità elettrodo; alimentazione accumulatore, altezza 9 mm, profondità 26 mm, larghezza 20 mm, peso 6 g (C); una panoramica dei componenti TWS utilizzati per questo test: (1) testa tappa unità con accumulatore montato sul cranio umano, (2) ricetrasmettitore l’unità collegata al computer porta USB, software di TWS (3) (D); Foto di un ratto liberamente muoversi e Mostra la fase testa TWS connected to il microelettrodo unità precedentemente impiantati (E) e il software TWS mostrando segnali registrati esemplari (F). La fase di testa TWS fornisce tempo reale pattern di stimolazione impostata tramite interfaccia utente grafica del software TWS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: interfaccia di utente grafica software TWS, registrazione schermo. Le prestazioni di registrazione di TWS con un elettrodo bipolare singola registrazione, impiantato nel collicolo inferiore, sono raffigurata sullo schermo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: interfaccia di utente grafica software TWS. schermata di stimolazione (A) e (B) le specifiche dei parametri di stimolazione. I parametri di segnale di stimolazione (C) come larghezza di impulso (PxW), ampiezza di impulso (PxA), inter ritardo di impulso (IPD), il tempo tra gli impulsi (TBP), impulso al treno (PPT) e tempo tra treni (TBT) sono regolabili tramite interfaccia di utente grafica software TWS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Confronto qualitativo tra un segnale multi-unità registrata extracellularly con TWS (A) e una configurazione di registrazione via cavo (B). Entrambe le registrazioni sono state ottenute dalla stessa TWS microelettrodo unità (impedenza 0.5MOhm) impiantata nel collicolo inferiore. Distanza assiale tra i due contatti di elettrodo di registrazione era circa 400 µm. La registrazione di larghezza di banda del sistema via cavo e TWS erano identici (500 Hz… 5 kHz), i segnali sono stati campionati con 40 (sistema metallico) e 32 kHz (TWS). Entrambi i sistemi registrati attività multi-unit con una qualità di segnale simile. Non c’è nessuna chiara differenza di tassi tra il TWS e registrazioni via cavo di infornamento. Forma d’onda del potenziale d’azione del neurone da entrambe le registrazioni sono mostrati nel A ‘e B’. Parametri di stimolazione simili erano necessari per 4 ratti raggiungere la soglia di fuga utilizzando un sistema legato (TS) o TWS (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Movie 1: Un ratto esemplare presente normale comportamento esplorativo durante il test di labirinto plus. TWS permette all’animale di entrare le braccia aperte e chiuse senza fili sempre aggrovigliati fino nell’apparato di test, ma è piccolo e abbastanza leggero che interferisce solo in minima parte nell’attività stessa. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Qui, è stato presentato un sistema di registrazione e stimolazione wireless ampiamente accessibile per studi elettrofisiologici e comportamentali in animali liberi di muoversi. TWS è stato convalidato in dosaggi comportamentale utilizzando il colliculus inferiore come una struttura del modello. L’approccio TWS ha diversi vantaggi rispetto a quelli esistenti. In primo luogo, il sistema utilizza un singolo portatile TWS testa-palco dotato di un preamplificatore e una batteria ricaricabile, che permette registrazioni stabile a lungo termine per 1 h con la stessa batteria e operazioni wireless distanza per fino a 5 m. in secondo luogo, la fase di testa TWS è leggera e compatta, peso 12 g compresa la batteria ed è stato sviluppato per impedire il ratto da rimozione della fase di testa e masticare i fili. È stato tollerato dagli animali dal alcun impatto sul repertorio comportamentale umano con e senza il TWS fase testa è stata osservata, rendendo il sistema applicabile a una vasta serie di attività comportamentali. In terzo luogo, il sistema trasmette in tempo reale. In quarto luogo, attraverso la registrazione simultanea bidirezionale e stimolazione dell’attività neurale, il sistema fornisce un sofisticato strumento per valutare i rapporti causali tra pattern di attivazione specifiche del cervello e comportamento, superando così le carenze dei sistemi unidirezionali. Questa caratteristica rende il metodo particolarmente prezioso per il campo di stimolazione cerebrale profonda, che richiede solitamente la valutazione precisa, il monitoraggio e la regolazione dei parametri di stimolazione durante gli esperimenti comportamentali a lungo termine. Infine, un’unità di microelettrodi cronicamente impiantabile è stata sviluppata con integrato di registrazione, stimolazione ed elettrodo di riferimento che può essere facilmente impiantato durante una chirurgia stereotassica convenzionale. Da questo punto di vista, TWS è un sistema wireless integrato che aumenta la riproducibilità degli esperimenti di stimolazione e registrazione. La qualità di registrazione di TWS è stata indicata per essere simile alla qualità di registrazione ha reso con un sistema di registrazione via cavo commercialmente disponibile (vedere Figura 5).

È ampiamente noto che la stimolazione elettrica del colliculus inferiore nel ratto suscita chiaro comportamento di fuga caratterizzata da corsa o il salto, che imita le reazioni alla paura hanno suscitato da sfide ambientali11,12, 13. Questo comportamento è stato indotto nel presente studio stimolando il colliculus inferiore utilizzando il TWS o il tradizionale sistema legato. Al fine di testare l’efficacia della stimolazione di TWS, le soglie di fuga – intensità corrente minima produzione di corsa o il salto – sono state confrontate usando entrambi i sistemi. Ratti con la tappa di testa TWS sono capaci di correre velocemente, saltare e arrampicarsi fuori campo aperto, ossia l’indicazione comportamento tipico di fuga, con una maggiore libertà di movimento. D’importanza, le soglie di fuga erano simili rispetto al tradizionale sistema tethered. Insieme, un paradigma piuttosto impegnativo è stato utilizzato per testare la resilienza di TWS, che ha acquistato padronanza in modo spensierato.

TWS è adatta anche per esperimenti di stimolazione elettrica cronica, poiché l’unità microelettrodo impiantato permette l’uso cronico. TWS permette di regolare i parametri correnti di stimolazione molto proprio in un modo di rilevare con precisione la frequenza e la quantità di stimolazione attuale che è efficace per suscitare una risposta comportamentale. Inoltre, lo stesso animale è stato stimolato con la stessa soglia di corrente 3 giorni più tardi e la stessa risposta comportamentale desiderata è stato tratto. Ciò suggerisce che il tessuto intorno alla punta dell’elettrodo di stimolazione non è stato danneggiato dallo stimolo attuale che richiede solitamente la stimolazione aumentata ampiezza corrente con stimolazioni ripetute al fine di suscitare la stessa risposta comportamentale.

Inoltre, è possibile ridurre significativamente il tempo sperimentale perché il micro TWS-stimolatore aggiorna in tempo reale i parametri di stimolazione quando lo sperimentatore li modifica nell’interfaccia utente grafica. Altri stimolatori elettrici19 utilizzato per necessità di ricerca preclinica per essere riprogrammato per aggiornamento del parametro di stimolo. In questi casi, il dispositivo è programmato tramite il tethering l’animale tramite cavo a un’unità di programmazione. Questo non è necessario quando si utilizza il TWS.

Infine, la batteria è fissata alla parte superiore del palco testa TWS e collegati elettricamente alla fase testa tramite un connettore a due poli magnete per facile cambio della batteria. Il vantaggio è che durante l’esperimento è possibile cambiare la batteria senza scollegare la fase testa TWS dall’unità elettrodo impiantato, che è molto più confortevole per l’animale. Durante lo studio presente, abbiamo usato una batteria in cui il tempo di funzionamento è solo 1 h. Nel caso in cui l’esperimento richiede più di 1 h, è consigliabile avere una batteria carica aggiuntiva disponibile. TWS è collegabile alla sostituzione batterie ricaricabili con capacità di (i) 230 mA per tempo di funzionamento di 1 h o (ii) 450 mA per circa 2,5 ore di funzionamento. Entrambi i tipi di batterie possono essere ricaricati completamente in 15 min.

In sintesi, lo studio presente descrive il funzionamento di TWS progettato per stimolazione neurale e la registrazione da comportarsi liberamente piccoli animali. Un insieme completamente integrato di unità impiantabile microelettrodo, fase testa, ricevitore e il software è presentato come bene. La qualità della registrazione senza fili e stimolazione è simile a che del tethered registrando il sistema con il vantaggio di essere più confortevole, leggero e sicuro per l’animale. Di conseguenza, TWS può essere utilizzato per sostituire il sistema legato poiché esso non limita la mobilità dell’animale e fornisce un metodo flessibile per controllare la stimolazione e registrazione neurale in circostanze dove altri approcci sarebbe difficile o impossibile. Di conseguenza, TWS può essere uno strumento importante per indagare su attività come elettrica nei circuiti neurali definiti genera alcune forme di comportamento, una questione fondamentale in neuroscienze.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da un grant di ricerca dalla Federazione tedesca delle associazioni di ricerca industriale (AiF; concessione numero: KF2780403JL3).

Materials

Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 Thomas RECORDING GmbH AN001165 The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well.
Software for Thomas Wireless System (TWS) Thomas RECORDING GmbH inlcuded in AN001165 The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation.
Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001132 Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user
Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001118 Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm
Holder for electrode implantation Thomas RECORDING GmbH AN000838 Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001208 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001209 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g)
Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator Thomas RECORDING GmbH AN001207 Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209)
Water soluble glue Thomas RECORDING GmbH AN001080 Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms
Miniature differential preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000329 The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs.
Connection cable Thomas RECORDING GmbH AN000330 Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply.
Rechargeable power supply for the miniature preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000328 Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2).
Accumulator charger (US) Thomas RECORDING GmbH AN000167 Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor)
Accumulator charger (EU) Thomas RECORDING GmbH AN000168 Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector)
Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter Thomas RECORDING GmbH AN000677 TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz.
USB Oscilloscope Thomas RECORDING GmbH AN001096 USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software.
Stimulus generator Multichannel Systems STG3008-FA Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform.
Cap protector for the electrode Thomas RECORDING GmbH AN001193 Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System
Surgical equipment Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds
Drugs and chemicals Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol;
Fixation material including Stainless steel screws (BN650 M1.2×5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany);
Additional material Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline.
Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) Thomas RECORDING GmbH AN000287 The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study
Video camera EverFocus EverFocus, model: EQ150
Open field Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm
Elevated plus maze Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor.
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参考文献

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Melo-Thomas, L., Engelhardt, K., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).
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