Secundária degeneração das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. Este estudo descreve uma abordagem inovadora e operativa para transecção parcial nervo óptico. O uso dessa abordagem operativa de economia de espaço amplia gama de aplicação do modelo e permite a exploração dos mecanismos de lesão secundária em RGCs de uma maneira nova.
Estudos anteriores mostraram que a degeneração secundária das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. A transecção parcial nervo óptico é considerada um modelo útil e reprodutível. Comparado com outros modelos de lesão do nervo óptico comumente usados para avaliar a degeneração secundária, por exemplo, completa nervo óptico transecção e modelos de esmagamento do nervo óptico, o modelo de transecção parcial nervo óptico é superior, como distingue primário de degeneração secundária em situ. Portanto, ele serve como uma excelente ferramenta para avaliar a degeneração secundária. Este estudo descreve uma nova abordagem operativa da transecção parcial nervo óptico acessando diretamente a área do nervo óptico retrobulbar através da parede lateral orbital do globo ocular. Além disso, apresentamos um instrumento cirúrgico recentemente projetado, de baixo custo para ajudar com transecção. Como demonstrado pelos resultados representativos na distinção entre o limite das áreas de lesão primária e secundária, a nova abordagem e o instrumento garante alta eficiência e estabilidade do modelo, fornecendo o espaço adequado para a operação cirúrgica. Isto por sua vez torna mais fácil para separar a bainha meníngea e vasos oftálmicos do nervo óptico antes transecção. Um benefício adicional é que esta abordagem operativa de economia de espaço melhora a capacidade dos investigadores para administrar drogas, transportadoras ou traçadores RGC seletivas para o coto do nervo óptico parcialmente necrosante, permitindo a exploração de mecanismos subjacentes lesão secundária em RGCs, de uma maneira nova.
Degeneração secundária ocorre geralmente no sistema nervoso central (SNC) após lesões traumáticas e seguintes doenças neurodegenerativas agudas e crônicas. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 a morte de neurônios e células gliais como uma consequência antecipada dos eventos patológicos primários é denominada degeneração primária, enquanto degeneração secundária refere-se à morte de neurônios e células gliais, que não são ou apenas parcialmente afetadas pela primária danos. Degeneração secundária de RGCs também é acredita para ocorrer no glaucoma. 6 . Yoles et al 7 confirmou que a lesão secundária de RGCs ocorre no modelo de lesão do nervo óptico. Eles mostraram que neurônios cujos axônios não ficaram feridos depois que um dano agudo eventualmente irão degenerar devido ao ambiente degenerativo produziram por lesão em torno destes axônios. Esta degeneração secundária afeta os neurônios de forma progressiva, relacionados com a gravidade dos danos infligidos. Até agora, os mecanismos subjacentes danos RGC no glaucoma permanecem pouco claras, especialmente aqueles relacionados a lesão secundária, o que resulta em tratamento clínico insuficiente. 8 , 9 , 10 portanto, é necessário explorar os mecanismos subjacentes de degeneração secundária de RGCs durante o desenvolvimento do glaucoma. 11 criação de modelos animais de lesão secundária que pode avaliar quantitativamente o tamanho, distribuição e mecanismo de degeneração secundária de RGCs atrai cada vez mais a atenção de cientistas estudando lesões secundárias de RGCs.
Para esclarecer esta questão, estabeleceu-se um modelo do rato PONT por Luiz-Verbin et al 12 para avaliar lesão axonal induzida por degeneração e morte de RGCs. Este modelo é acredita-se que constituem uma boa ferramenta para explorar os mecanismos da degeneração secundária e identificar os potenciais agentes neuroprotective. O instrumento usado para gerar este modelo de lesão secundária é uma faca de diamante com uma escala de transecto quantitativamente, definindo a profundidade da abscisão através do botão de discagem, para completar uma quantitativa transecção do nervo óptico. O caminho cirúrgico aproxima-se da conjuntiva ocular ascendente ou temporal. Durante o processo operacional, a retina e o nervo ótico pode ser afetado pela força de pinça, que por sua vez, pode causar lesões primárias. Mais importante, devido ao espaço limitado do nervo óptico exposto, é difícil separar a bainha meníngea antes da incisão. Portanto, é possível danificar os vasos oftálmicos durante transecção parcial nervo óptico, que resulta em isquemia da retina e o fracasso do modelo. Além disso, a faca de diamante é cara, e cada utilização diminui a nitidez de ponta. Isto por sua vez pode afetar a profundidade e o efeito da modelagem.
O modelo de degeneração secundária de RGCs descrito neste estudo foi obtida através de uma nova abordagem operativa da parede orbital lateral do globo ocular. Esta nova abordagem operativa acessa diretamente o nervo óptico retrobulbar rodeado pelo cone muscular orbital, evitando lesão primária para o globo ocular e nervo óptico quando puxando para baixo ou para o lado nasal lateral do globo ocular. Isto também aumenta o espaço de operação cirúrgica durante o estabelecimento de modelo e permite o isolamento de bainha meníngeos antes parcialmente cruza o nervo óptico. É importante notar que o envolvimento inadvertido e lesão dos vasos oftálmicos podem levar ao fracasso do modelo. Além disso, o modelo permite uma acompanhamento avaliação das células transfectadas, drogas e reagentes no tronco do nervo óptico parcialmente necrosante. O instrumento cirúrgico auto-concebidos é barato e pode ser usada várias vezes, reduzindo assim o custo da modelagem. O modelo de lesão secundária de RGCs estabelecido por este método foi mostrado para ter estabilidade e boa reprodutibilidade.
Procedimento operacional
Existem alguns pontos dignos de observação no processo de construção do modelo. Na etapa 4.2, o movimento cirúrgico deve ser realizado com cuidado para evitar danificar a vasculatura acima do músculo subfascial. Especialmente, quando corta a fáscia subcutânea no canto do olho lateral exterior, fórceps de serra afiada deve ser usado para puxar para cima a fáscia subcutânea na superfície de fáscia verticalmente; a fáscia deve ser cortada com Vannas tesoura de mola para evitar danificar a veia orbital para o canto externo, que pode resultar em falha do modelo por sangramento excessivo. Passo 4.3 tem a vantagem de potencialmente prevenir sangramento quando removendo diretamente de vasos sanguíneos. Na separação orbitais músculos em passo 4.5, a razão para colheita fórceps de serra afiada mas não Vannas tesoura de mola é evitar o sangramento contínuo e hemorragia. Sem rodeios, os músculos são separados em ambos os lados na direção perpendicular da incisão na pele fáscia; Enquanto isso, os músculos profundos da órbita são esticados para fora e perifericamente. Este procedimento irá revelar mais profundas porções da cavidade orbital, proporcionando uma maior janela cirúrgica e permitindo o acesso irrestrito aos tecidos sobrepondo o nervo óptico. Nos procedimentos acima, se o sangramento ocorre, pressão deve ser aplicada usando estéril cirúrgica ou cotonetes. Menor sangramento para após alguns segundos por esse procedimento. O objetivo da etapa 4.6 é facilitar as operações de acompanhamento para remover facilmente alguns músculos gordos e separados do cone do músculo de órbita para expor o nervo óptico ao longo da direção do nervo óptico na profundidade orbital.
As partes mais críticas do atual protocolo são etapas 5.1-5.6. É importante para não danificar o sistema vascular ao redor da cabeça do nervo óptico. O nervo óptico deve ser seccionado parcialmente pelo menos 1.5-2.0 mm na parte de trás do olho, para evitar danos à artéria oftálmica que penetra o nervo dentro de 1 mm do olho e fornece sangue para a retina interna. A finalidade de cortar o reto lateral é conseguir a melhor exposição do nervo óptico como o reto lateral é largo e obviamente bloqueia a vista do nervo óptico. Entretanto, para evitar a remoção da artéria oftálmica que está associada com a bainha meníngea (Figura 5), é necessário separar, dissociar a dura-máter em torno do nervo óptico e examinar o padrão vascular da bainha meníngea, usando fórceps para girar suavemente a bainha. Além disso, uma área desprovida de vasos sanguíneos deve ser identificada, permitindo um corte longitudinal na bainha meníngea. Também é necessário manter uma pequena distância de trabalho na parte de trás do olho, para evitar a parte da dura-máter que está intimamente associada com a artéria oftálmica. A retina é normalmente transparente, e os vasos sanguíneos podem ser claramente demarcados. No caso de fornecimento de sangue da retina danificada, a retina é degenerada, levando a uma aparência de floculante branco leitoso. Câmara de vítreo do olho e a lente normalmente se tornará nublada, bem como, com tamanho de olho diminuiu ao longo do tempo. Neste estudo, imagens pré-operatórias e pós-operatório de fundo não confirmaram nenhum dano para o suprimento de sangue do fundo no modelo depois de aplicar as etapas acima.
Além disso, cuidado especial é necessário em diversas etapas deste modelo. Ao usar fórceps afiado-curvo-serrilhada ou outros instrumentos cirúrgicos para expor o nervo óptico, o cirurgião deve evitar força excessiva, pois pode danificar o nervo óptico, o globo ocular ou a artéria oftálmica, resultando em lesões primárias e isquemia da retina. Além disso, vasos sanguíneos que irrigam o olho deve não ser danificados, para evitar sangramento sustentado, que poderia conduzir à falha de modelagem. O SSAI usado neste experimento requer o uso de delicadas. Quando o nervo óptico é colocado dentro do sulco do instrumento, o nervo óptico e a superfície estriada precisam ser montado firmemente para garantir boa consistência e repetibilidade de cada modelo animal. Com a prática, o procedimento cirúrgico completo pode ser concluído dentro de 15-20 minutos por olho, após os entrada inicial de cortes foram feitos.
Wang et al. 19 publicou um modelo animal semelhante de transecção parcial nervo óptico estabelecida usando um amputator quantitativa do nervo óptico. Os procedimentos cirúrgicos inclui: 1) corte separados o canto exterior, suspensão e fixação do palpebral superior; 2) explorando o nervo óptico e cruza a porção superior do nervo óptico, usando o amputator; e 3) sutura a conjuntiva e a pele. Embora o procedimento cirúrgico foi relativamente simples, os seguintes problemas foram encontrados durante a operação. Embora incisão lateral canto poderia expor determinado espaço para a operação, houve uma inevitável necessidade de constantemente esticar o globo ocular para expor a bainha do nervo óptico retrobulbar, especialmente quando os cirurgiões desejavam para expor um mais retrobulbar bainha do nervo óptico para facilitar ainda mais o isolamento de bainha; a força de alongamento do globo ocular foi maior, que é susceptível de causar lesão direta da tração do globo ocular e nervo óptico. Nenhuma atenção especial para os vasos sanguíneos que podem ser cortados em conjunto com a bainha do nervo óptico, e danos aos vasos sanguíneos são susceptível de conduzir a criação de modelo falhado. Os principais procedimentos do modelo de lesões secundárias descritas neste documento são: um novo agente aproximar-se da parede orbital lateral do globo ocular para acessar diretamente o nervo óptico retrobulbar rodeado pelo cone muscular orbital, evitando lesão primária para o globo ocular e nervo óptico, ao puxar para baixo ou para o lado nasal lateral do globo ocular. Esta nova abordagem operacional aumenta o espaço de operação cirúrgica durante a modelagem e permite fácil isolamento da bainha meníngeo, que está intimamente associada com a artéria oftálmica, antes transecção parcial do nervo óptico. Transecção parcial nervo óptico foi realizada com um instrumento cirúrgico auto-concebidos, que é custo-eficaz e reutilizáveis, reduzindo o custo geral de modelagem. Estrutura orbital do rato é diferente de outros mamíferos, com a órbita mais próximo do canto do olho e sem estrutura óssea, mas coberto com músculos. A abordagem cirúrgica pode atingir a parte posterior do globo ocular sem a necessidade de destruir o osso orbital e periósteo. Através de rigorosa desinfecção pré-operatória e pós-operatória profilaxia antibiótica, infecção, inflamação e edema foram bastante reduzidos.
Auto-concebidos instrumento cirúrgico de assistente
O modelo do rato de transecção parcial nervo óptico foi criado usando o instrumento auto-concebidos assistente cirúrgico, cujas principais características são as seguintes. Pode ajudar na transecção quantitativa parcial do nervo óptico exposto à borda estriada, também garantindo a transecção consistência entre animais diferentes. Nós testamos e verific a repetibilidade de estabelecimento de modelo com SSAI. O máximo coeficiente de variação foi de 1,85%, com um valor médio 0,67% ±0. 44%. 20 estes resultados indicam que o SSAI poderia ser usado para estabelecer modelos de transecção parcial nervo óptico, com satisfatória reprodutibilidade e uniformity.
Largura a superfície estriada e o design do semicírculo da superfície interna do sulco podem ter um efeito mais fixo no nervo óptico e tornar a superfície estriada e nervo óptico anexar mais firmemente, também diminuindo erros experimentais e reações adversas. A borda estriada permite uma melhor proteção do nervo óptico no sulco durante a operação, que não irá danificar o nervo óptico no sulco, independentemente de nitidez do cortador. Outra vantagem da borda estriada é a prevenção de lesões de esmagamento durante a transecção do nervo óptico.
É apropriado para operar no espaço profundo e estreito. Embora a nova abordagem operativa foi expandida, o caminho continua a ser profundo, e o polo à mão e da articulação podem ser usados para colocar a cabeça estriada facilmente sob a bainha do nervo óptico para executar operações de acompanhamento. Quando o instrumento é usado para a operação, uma vasta gama de cortadores pode ser usada para transecção, por exemplo, uma ponta de agulha 26G. Até mesmo uma faca de safira sonda cirúrgica pode ser selecionada para evitar contusão e esmagar os ferimentos causados por uma tesoura. Sulco superfícies podem ser feitas em diferentes profundidades verticais para completar vários graus de corte do nervo óptico.
Comparado com o amputator de Wang et al . o SSAI tem uma estrutura mais simples. Além disso, a etapa de corte é mais conveniente usar o SSAI, com maior consistência e repetibilidade do modelo animal. Finalmente, a gama de ferramentas aplicáveis para o corte com o SSAI também é mais ampla. Em conclusão, SSAI, que faz incisões quantitativas e uniformes do nervo, pode servir como um instrumento eficaz para o estabelecimento de modelos do rato para avaliar a transecção do nervo óptico.
Características do modelo de transecção parcial nervo óptico rato
O modelo de transecção parcial nervo óptico é útil para avaliar a degeneração secundária no RGCs. O mérito potencial deste modelo é a capacidade de separar primário de degeneração secundária com precisão em situ, tanto no nervo óptico e retina. Os nervos ópticos centrais e ventrais foram mais suscetíveis à lesão secundária após a transecção parcial (aproximadamente 1/3 a 1/2) do nervo óptico dorsal (Figura 6). Na retina, a localização regional das lesões primárias e secundárias da RGCs deve basear-se a topografia do nervo óptico, correspondendo a RGCs da retina após a transecção parcial. Se a retina inteira do rato é dividida em peças (inferiores) ventrais e dorsal (superior), lesões primárias e secundárias estão presentes em ambas as partes. No entanto, com base na relação entre RGCs na retina e o axônio do nervo óptico, RGC morte na retina ventral deve ser principalmente atribuída a lesão secundária (Figura 3). 12 , 22 , 23 as vantagens de incluir este modelo: instrumento simples e fácil de operar com os procedimentos padrão; nenhum efeito sobre os vasos oftálmicos; boa reprodutibilidade e estabilidade. Esta técnica pode ser usada para transfect RGCs com esta abordagem operativa de economia de espaço, aplicando curtos interferentes RNAs (siRNAs), plasmídeos, e desafiar a vetores virais para o nervo óptico parcial; Além disso, os reagentes podem ser colocados no tronco para o tratamento seletivo ou rotulagem de RGCs parcial nervo óptico.
Lesões totais, primários e secundários de RGCs coexistiram após a transecção parcial nervo óptico neste modelo animal, com um limite claro na retina entre os tipos de duas lesões. Embora a Associação dos axônios do nervo óptico e RGC localização na retina precisa investigação adicional para uma distinção mais precisa, esta abordagem operativa de economia de espaço aumenta a gama de aplicação do modelo e permite que os pesquisadores explorar o mecanismos de lesão secundária no RGCs de uma maneira nova.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Fundação ciência Natural Pequim (7152038), os fundos de pesquisa Fundamental para as universidades Central da Central South University (2016zzts162) e Science Foundation de Aier Eye Hospital grupo de pesquisa (Grant no. AF156D11). Finalmente, Fancheng Yan Obrigado Yiping Xu pelo inestimável apoio ao longo dos anos.
Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
Fluorogold | Biotium | 80014 | |
Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |