Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Imunidade fornecida pela vacina contra a gripe sazonal tradicionalmente tenha sido avaliada pela hemaglutinação (HI) de inibição do ensaio¹, que mede a presença de anticorpos que visam o sítio de ligação do receptor da hemaglutinina. Estes anticorpos HI-ativo podem conferir imunidade esterilizante, mas são geralmente estreitos em sua amplitude de proteção, oferecendo imunidade para apenas um seleto poucos estirpes do vírus gripe. O isolamento e caracterização de amplamente reativos anticorpos monoclonais que reconhecem a hemaglutinina (HA) sugerem que o desenvolvimento de uma vacina universal da gripe está ao alcance de^{3,2,4, 5 , 6 , 7 , 8}. um dos objectivos principais de uma vacina universal da gripe é induzir uma resposta do anticorpo forte em direção as regiões conservadas do vírus da gripe^{9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16}. amplamente reativos anticorpos que reconhecem estes resumos conservados, composto de neutralizantes e não-neutralizando anticorpos^17,18, foram mostrados para exigir Fc-FcγR interações para ideal proteção na vivo e destacar a contribuição da imunidade mediada por Fc para a resposta imune geral a gripe vírus^19,20.

Correlações de proteção são cruciais na avaliação de imunidade à infecção. Essas métricas permitem que os cientistas e médicos estimar a eficácia das vacinas, o significado dos dados e o curso do tratamento. O único estabelecido correlato de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe é o ensaio de inibição da hemaglutinação. Um título de 01:40 é associado com uma redução de 50% no risco de doença^1,21 – e reflete a presença de anticorpos que inibem a aglutinação alvejando o receptor binding site localizado na cabeça globular do HA. No entanto, também deve ser notado que respostas de células T podem ser uma melhor correlação de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe em idosos. Curiosamente, um relatório recente sugere que a atividade de inibição de neuraminidase pode ser um melhor preditor de imunidade à gripe²². Felizmente, típico em vitro ensaios tais como ensaios de inibição de neutralização ou neuraminidase podem medir os anticorpos de talo ou neuraminidase-específicos HA. A maioria destes ensaios convencionais em vitro , no entanto, só leva em conta a função da região de ligação do antígeno do anticorpo e não meça o papel da região de Fc. Além disso, a contribuição dos anticorpos não neutralizantes que proteger via Fc receptor noivado na vivo não são detectados^17,18. Para medir a proteção conferida pelos anticorpos que induzem a imunidade mediada por Fc como citotoxicidade mediada de célula dependente de anticorpo (ADCC), é necessário um ensaio robusto em vitro .

O método descrito abaixo avalia a capacidade de murino anticorpos monoclonais para induzir funções Fc-mediada através da utilização de uma linhagem de células Jurkat geneticamente modificada expressando uma ativando murino digite 1 FcR, FcγRIV. Noivado de anticorpo da FcγR transduces esse fator nuclear de gatilhos de atividade luciferase mediada por células T ativadas de sinalização intracelular. O ensaio tem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais que exigem isolamento e cultura de células efetoras primário e o uso da citometria de fluxo para detectar a ativação do efetor mediada por Fc funções^{19,23,24 ,25,26}. Em primeiro lugar, o protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para incorporar diferentes alvos virais, FcγRs e anticorpos de diferentes espécies (humanos e murino). Em segundo lugar, o uso de um modificado células Jurkat linha expressando uma FcγR com um gene do repórter do luciferase sob um fator nuclear das células T ativadas (NFAT) permite a um ensaio de grande formato que pode ser facilmente analisado usando um leitor de placa medindo luminescência. Aqui, a tradicional ativação de células efetoras primário é substituída com a indução do NFAT-luciferase sobre noivado de anticorpo de um FcγR na superfície da célula Jurkat. Este ensaio de formato de placa de 96 poços permite a medição de até quatro diferentes amostras em triplica com sete diluições – um número de amostras que poderia ser complicado usando técnicas tradicionais. Existem pontos adicionais a serem considerados com este ensaio que pode afetar o projeto de experimentos e interpretação de dados. O alvo viral deve ser expressos na superfície da pilha em ordem para reconhecimento de anticorpos. Para atenuar isso, o antígeno alvo (por exemplo, uma proteína viral interna) pode ser revestido diretamente na superfície de uma placa. No entanto, isto não ainda foi rigorosamente testado. Além disso, a linhagem de células Jurkat modificada expressa apenas um tipo de ativação FcγR e não expressa qualquer FcγRs inibitório, enquanto linhas de célula primária expressam todos os receptores em um contexto fisiológico.

Utilizámos anteriormente neste ensaio para demonstrar que o epítopo especificidade em um contexto de polyclonal desempenha um papel crucial na regulação de funções efetoras mediada por Fc e que ideal ativação da resposta de mediada por células dependente de anticorpo requer dois pontos de contato^27,28. Aqui, descrevemos um método que avalia a capacidade dos anticorpos monoclonais específicos do talo para engajar e ativar o murino ativando FcγRIV. Embora haja exceções^29,30, um grande número de anticorpos reativos amplamente região da haste antigenicamente conservada a hemaglutinina de destino e, portanto, desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma gripe universal vacina.