概要

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

Published: February 23, 2018
doi:

概要

يصف لنا طريقة لقياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة لجنة التيسير بالأجسام المضادة التي تستهدف هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا. يمكن تكييفها مع هذا التحليل أيضا لتقييم القدرة [مونوكلونل] أو [بولكلونل] سيرا استهداف glycoproteins السطحية الفيروسية الأخرى للحث على الحصانة بوساطة لجنة التيسير.

Abstract

الأجسام المضادة تلعب دوراً حاسما في اقتران الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف ضد مسببات الأمراض الفيروسية من خلال مستضد ملزمة مجالات ومناطق Fc. هنا، ونحن تصف كيفية قياس التنشيط من نادي اكتب وظائف المستجيب بالأجسام المضادة استهداف هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا باستخدام خط الخلية جوركات المهندسة وراثيا معربا عن تفعيل لجنة التيسير 1-FcγR-باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تحديد مساهمة تفاعلات Fc FcγR محددة يمنحها المناعية باستخدام فحص في المختبر .

Introduction

وقسمت تقليديا الحصانة التي يوفرها لقاح الإنفلونزا الموسمية من hemagglutination تثبيط (مرحبا) المقايسة1، الذي يقيس وجود الأجسام المضادة التي تستهدف موقع مستقبلات ملزم هيماغلوتينين. هذه الأجسام المضادة النشطة مرحبا يمكن أن يضفي حصانة تعقيم، ولكن عموما ضيقة في اتساع تلك الحماية، وتوفير الحصانة لفقط تحديد سلالات قليلة من فيروس الإنفلونزا. عزل ووصف رد الفعل على نطاق واسع [مونوكلونل تعترف هيماغلوتينين (ها) تشير إلى تطوير لقاح الإنفلونزا العالمي هو في متناول اليد، 2،،من34 5 , 6 , 7 , 8-أحد الأهداف الرئيسية من لقاح الإنفلونزا العالمي للحث على استجابة جسم قوي نحو المناطق المصانة من الإنفلونزا فيروس9،10،،من1112 , 13 , 14 , 15 , 16-على نطاق واسع ورد الفعل من الأجسام المضادة التي تعترف هذه يحافظ [ابيتوبس]، تتألف من إبطال وعدم تحييد الأجسام المضادة17،18، تبين أن تتطلب تفاعل Fc-FcγR للأمثل الحماية في فيفو وتسليط الضوء على مساهمة لجنة التيسير بوساطة الحصانة للاستجابة المناعية الإجمالية لفيروس الإنفلونزا19،20.

يرتبط الحماية تشكل عاملاً حاسما في تقييم مناعة ضد العدوى. هذه المقاييس تسمح للعلماء والأطباء لتقدير فعالية اللقاحات، وأهمية البيانات، وأثناء العلاج. ربط المنشأة الوحيدة للحماية ضد عدوى فيروس الإنفلونزا هو مقايسة تثبيط هيماجلوتيناتيون. يرتبط بتخفيض 50% في خطر المرض1،21 -عيار من 01:40 ويعكس وجود الأجسام المضادة التي تمنع تراص باستهداف مستقبلات ملزم موقع يقع على رأس كروي ها. ومع ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أن الاستجابات تي خلية ربط أفضل من الحماية ضد عدوى فيروس الإنفلونزا لدى كبار السن. من المثير للاهتمام، تقرير صدر مؤخرا يشير إلى أن النشاط تثبيط النورامينيداز قد تكون مؤشرا أفضل من الحصانة للأنفلونزا22. لحسن الحظ، نموذجية في المختبر فحوصات مثل فحوصات تثبيط تحييد أو النورامينيداز يمكن قياس الأجسام المضادة المحددة ساق أو النورامينيداز هكتار. معظم هذه الاختبارات التقليدية في المختبر ، ومع ذلك، فقط تأخذ في الاعتبار الدالة لمنطقة مستضد ملزمة الجسم ولا تقيس دور منطقة Fc. بالإضافة إلى ذلك، المساهمة غير تحييد الأجسام المضادة التي تحمي عن طريق نادي مستقبلات المشاركة في فيفو لا الكشف عن17،18. من أجل قياس الحماية من الأجسام المضادة التي تحفز الحصانة Fc بوساطة مثل جسم الخلية التابعة بوساطة سيتوتوكسيسيتي (ADCC)، يلزم مقايسة قوية في المختبر .

الطريقة الموضحة أدناه ويقيم قدرة الأجسام المضادة مورين للحث على مهام لجنة التيسير بوساطة من خلال استخدام خط خلية جوركات معدلة وراثيا معربا عن تفعيل الفاري اكتب 1 FcR، FcγRIV. مشاركة FcγR جسم ترانسدوسيس داخل الخلايا مما يشير إلى أن العامل النووي مشغلات لوسيفراس تنشيط خلايا T-وساطة النشاط. التحليل مزايا عديدة على التقنيات التقليدية التي تتطلب العزلة والثقافة من خلايا المستجيب الأساسي واستخدام التدفق الخلوي للكشف عن التنشيط للمستجيب بوساطة Fc مهام19،23،24 ،،من2526. أولاً، بسهولة يمكن تكييفها لإدماج أهداف الفيروسية المختلفة، FcγRs، والأجسام المضادة من مختلف الأنواع (البشرية ومورين) البروتوكول هو موضح هنا. ثانيا، استخدام خلية جوركات تعديل خط معربا عن FcγR مع جين مراسل لوسيفراس تحت عاملاً نووية لتنشيط خلايا تي (نفات) يسمح شكل كبير مقايسة التي يمكن تحليلها بسهولة باستخدام قارئ لوحة قياس التﻷلؤ. هنا، يتم استبدال تنشيط خلايا المستجيب الأولية التقليدية مع إدخال نفات-لوسيفراس على جسم الاستعانة FcγR على سطح الخلية جوركات. يسمح هذا الفحص تنسيق لوحة 96-جيدا لقياس عينات مختلفة تصل إلى أربعة في تريبليكاتيس مع سبعة تخفيف – عدد من العينات التي يمكن أن تكون مرهقة باستخدام التقنيات التقليدية. وهناك نقاط إضافية للنظر مع هذا التحليل التي قد تؤثر على تصميم تجارب وتفسير البيانات. يجب التعبير عن الهدف الفيروسية على سطح الخلية من أجل الاعتراف بالضد. للتخفيف من هذا، قد المغلفة مستضد المستهدفة (مثل البروتينات فيروسية داخلية) مباشرة على سطح لوحة. ومع ذلك، هذا لم بعد يتم دقة اختبار. بالإضافة إلى ذلك، تعديل خط الخلية جوركات تعرب عن نوع واحد فقط من تفعيل FcγR ولا تعبر عن أي FcγRs المثبطة، بينما خطوط الخلايا الابتدائية التعبير عن جميع المستقبلات في سياق فسيولوجية.

وقد استخدمنا سابقا هذا الفحص لإثبات أن خصوصية حانمه في سياق [بولكلونل] يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظائف المستجيب بوساطة لجنة التيسير وأن التفعيل الأمثل للاستجابة تعتمد على جسم الخلية بوساطة يتطلب نقطتين من اتصل27،28. وهنا يصف لنا أسلوب الذي يقيم قدرة خاصة بساق الأجسام المضادة لإشراك وتفعيل الفاري تفعيل FcγRIV. على الرغم من أن هناك استثناءات29،30، عدد كبير من الأجسام المضادة لرد الفعل على نطاق واسع تستهدف منطقة ساق antigenically يحافظ هيماغلوتينين، وهكذا تلعب دوراً مهما في تنمية الإنفلونزا العالمي لقاح.

Protocol

وأجريت التجارب بريفورميد في هذه المخطوطة المؤسسية مدونة للتالية “آيكان كلية الطب” الأخلاقيات والأنظمة. 1-التعبير عن هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا عن طريق تعداء أو الإصابة تعداء: لوحة “الكلي الجنينية البشرية” (HEK 293T) الخلايا في كثافة من 2 × 104</su…

Representative Results

أظهرنا أن ماب ساق على حدة، 6F12، ولكن لا ماب الرأس الخاصة برئيس معين، PY102، وكان قادراً على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية الأساسية التي أوبريجولاتينج CD107a والانترفيرون γ19. نموذج لجسم ساق على حدة قادرة على تنشيط الخلايا ناغورني كاراباخ البشرية الأساسية، نظهر أن ماب ساق على حدة، 6…

Discussion

الأسلوب الموصوفة هنا يسمح للمستخدم لقياس قدرة جسم [مونوكلونل] هكتار على حدة للمشاركة FcγRIV موريني. هو أعرب عن مستضد المستهدفة، هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا، على سطح الخلايا بعد الإصابة بالفيروس أو تعداء بلازميد الحمض النووي. المقايسة زيادة قابلة لاستخدام البروتينات الفيروسية المختلفة أ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا المشروع في الجزء مع الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، والمعاهد الوطنية للصحة، وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، تحت سيرس العقد P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Materials

A549 cells  ATCC CCL-185 Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells
HEK 293T cells ATCC CRL-3216 Human embryonic kidney cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies  11668019 Transfection reagent
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-034
White tissue culture treated 96-well plate Corning, Inc.  3917 Assay plates
10X MEM Gibco 11430-030
Jurkat cell expressing murine FcgRIV Promega M1201 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa Promega G7010 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIa Promega G9901 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Luminometer BioTek Synergy H1 Multi-Mode reader Luminescence plate reader
Bio-Glo Luciferase Assay System Promega G7940 Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate
Madin Darby canine kidney cells ATCC CCL-34 Canine kidney cells

参考文献

  1. Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
  2. Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942 (2008).
  3. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  4. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  5. Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
  6. Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
  7. Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
  8. Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
  9. Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , (2014).
  10. Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
  11. Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
  12. Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95 (2016).
  13. Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
  14. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
  15. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
  16. Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
  17. Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
  18. Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).
  19. DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
  20. DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
  21. Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
  22. Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417 (2016).
  23. Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
  24. Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
  25. Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
  26. Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
  27. He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
  28. Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225 (2016).
  29. Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
  30. Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
  31. He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610 (2015).
  32. Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
  33. Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
  34. Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
  35. de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
  36. Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).

Play Video

記事を引用
Bailey, M. J., Broecker, F., Leon, P. E., Tan, G. S. A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies. J. Vis. Exp. (132), e56256, doi:10.3791/56256 (2018).

View Video