概要

Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Published: November 27, 2017
doi:

概要

O objetivo do protocolo é preparar o hidrolisado de queratina de penas de galinha por hidrólise alcalina-enzimática e testar se adicionando hidrolisado de queratina em uma base de pomada de cosméticos melhora a função de barreira da pele (aumentando a hidratação e diminuindo a perda de água transepidermal). Os testes são realizados em homens e mulheres voluntários.

Abstract

Hidrolisado de queratina (KHs) é componentes padrão estabelecido em cosméticos de cabelo. Entender os efeitos hidratantes do KH é vantajoso para cosméticos de cuidados com a pele. Os objetivos do protocolo são: (1) para processar o penas de galinha em KH por hidrólise alcalina-enzimática e purificá-la pela diálise e (2) para testar se adicionar KH em uma base de pomada (OB) aumenta a hidratação da pele e melhora a função de barreira da pele, diminuindo perda de água transepidermal (TEWL). Durante a hidrólise alcalina enzimáticos penas primeiro são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino e em seguida, sob condições suaves, hidrolisadas com enzima proteolítica. A solução de KH é diálise, vácuo seco e moído a um pó fino. Formulações cosméticas, compreendendo de óleo em emulsão de água (O/W) contendo 2, 4 e 6% do peso de KH (com base no peso do OB) estão preparados. Testar as propriedades hidratantes do KH é efectuado em 10 homens e 10 mulheres em intervalos de 1, 2, 3, 4, 24 e 48 h. testado formulações estão distribuídas em locais de antebraço volar desengordurados. A hidratação do estrato córneo (SC) é avaliada pela medição da capacidade da pele, que é um dos métodos usados e simples mais todo o mundo. TEWL baseia-se na medição da quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo da pele. Ambos os métodos são totalmente não-invasiva. KH faz para uma excelente oclusiva; dependendo a adição de KH no OB, ela traz uma redução de 30% em TEWL após a aplicação. KH também funciona como um umectante, como liga-se água de camadas inferiores da epiderme para a SC; com a adição de KH ideal no OB, se para 19% aumento da hidratação em homens e 22% ascensão nas mulheres ocorre.

Introduction

A indústria de curtumes, indústria alimentar e matadouros anualmente produzem imensas quantidades de subprodutos sólidos queratina – lã, penas, cerdas, cascos, garras, chifres e afins. De acordo com dados estatísticos mais recentes, o peso total de galinhas, perus, patos e outras aves abatidas nos EUA é 62,5 bilhões de libras por ano1; na União Europeia é aproximadamente 28,7 bilhões libras por ano. Considerando que as penas fazem até 8,5% do peso total das aves domésticas, os EUA sozinho produz anualmente aproximadamente 5,3 bilhões quilos de resíduos penas2.

Queratina é uma proteína que exibem alta resistência química, porque é fortemente reticulado com pontes dissulfeto que processam seu processamento difícil. Obtenção de produtos solúveis requer a clivagem de ligações cruzadas e possivelmente realizando a hidrólise das ligações peptídicas3. Clivagem das pontes dissulfeto pode proceder por meio de uma reação do ânion tiol de acordo com o seguinte padrão de4,5:

Sum + – SbSc– ↔ – Sb + – SaSc

Com um nível muito elevado de pH, hidrólise das pontes dissulfeto também aparece, em conformidade com o padrão6

-SS + → de OH S + -SOH

Sob condições suaves (pH aproximadamente 8), até mesmo sulfitolysis se realiza de acordo com o seguinte padrão:

– SS – + HSO3 → – SH + SSO –3

A forma mais econômica de degradar queratina é degradação microbiana, que se caracteriza por condições de reação suave durante processamento e alta repartição eficiência (ca. 90%)7,8. Keratinases são produzidas por algumas bactérias isoladas de solo e queratina resíduos9. Keratinases microbianas da hidrolise de estruturas rígidas e fortemente reticulado queratina10 e o KH resultante preparado é rico em proteínas solúveis, sem perda de aminoácidos essenciais detectado nele11.

A fim de incorporar uma proteína em preparações cosméticas (por exemplo, emulsões, loções e géis), os requisitos assegurem que tais proteínas são solúveis em água, os sistemas determinados são transparentes e que re-agregação dos peptides é evitada devido a interações hidrofóbicas. Portanto, uma prática comum é aplicar hidrolisados de proteínas, como colágeno hidrolisado, elastina e queratina. Ao adicionar hidrolisados em emulsões cosméticas, sejam tomadas medidas para assegurar que o hidrolisado primeiro é dissolvido em água. Em alguns casos, é desejável que a proteína (ou hidrolisado) é solúvel em álcool ou outros solventes orgânicos12.

KH é normalmente caracterizado em xampus, condicionadores, loções e soros nutritivos para o cabelo, bem como mascaras, unha polonês e agentes de maquiagem do olho. Os efeitos KH declarados geralmente incluem formando uma película protetora, alisando o cabelo ou unha estrutura, elevada plasticidade e aparência da formação tratada, regulando a consistência dos produtos e incentivando a formação de espuma13 , 14. também tem sido demonstrado que o KH reduz a tensão superficial, portanto, suplementação em cosméticos pode facilitar a redução na quantidade de emulsificante adicionado para estabilizar os cremes. KH limitar os efeitos da irritação provocada por detergentes (surfactantes) para a pele, olhos e cabelos, reduzindo assim os efeitos colaterais potenciais de detergente sobre o tecido (por exemplo, a desidratação da pele, dureza e função de diminuição da barreira de a pele). A alta capacidade de armazenamento em buffer de hidrolisados também é explorada para estabilizar o pH dos produtos cosméticos; peptídeos de menor comprimento têm um maior buffer efeito15,16. KHs se estabeleceram como componentes padrão no cabelo e cosméticos de unhas bem como sendo utilizado em produtos para cuidados com a pele, estudos sobre os efeitos hidratantes do KH não aparecem na literatura contemporânea.

Alcalino-enzimático tecnologia foi desenvolvida para o processamento de subprodutos de queratina em KH, e teste ativo está em processo sobre os efeitos de uma série de aditivos cosméticos17,18,19,20 , 21 , 22. a vantagem de dois estágios de hidrólise alcalina-enzimática usando proteases microbianas para penas de galinha atinge alta eficiência sob condições de reação suave e a qualidade do KH é muito elevada em contraste com a hidrólise empregada em ácidos fortes ou alcalinos. Na primeira fase, as penas são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino, que parcialmente interrompe a estrutura de queratina e incha as penas; Depois de ajustar o pH, as penas são hidrolisadas com uma enzima proteolítica em condições suaves na segunda fase. O KH dializado possui um alto teor de proteínas.

Efeitos do método descrito aqui são penas de aves de capoeira de processamento em um KH através de hidrólise alcalina-enzimática e testar o efeito das propriedades hidratantes de KH aplicada à cosmética emulsão O/W. As propriedades hidratantes são investigadas por métodos não-invasivos instrumental na vivo. Os métodos mais frequentes para medir a função de hidratação e barreira de pele de SC incluem medição de propriedades elétricas da pele (condutância ou capacitância). Diferentes métodos para investigar hidratação SC incluem perto método imaginando multiespectral infravermelho (NIM), espectroscopia de ressonância magnética nuclear, tomografia de coerência óptica ou transferência térmica transiente23. Função de barreira de SC se correlaciona com a TEWL de SC e é medido pelo método de câmara ventilada, método de câmara sem ventilação e câmara aberta método24.

Propriedades das formulações modelo são determinadas usando o sonda Multi adaptador 5 MPA com três tipos de sondas. A primeira coisa, corneometer CM 825, medidas da pele hidratação avaliando alterações na capacidade elétrica da superfície da pele; o capacitor de medição mostra alterações na capacidade da superfície da pele em unidades de corneometric. O corneometer dá apenas uma avaliação relativa da pele hidratação25. Para TEWL, a segunda sonda, tewameter TM 300, é usada para medir o gradiente de densidade de evaporação de água (em um instrumento de câmara aberta com base na lei de Fick difusão) da pele indiretamente por dois pares de sensores (temperatura e umidade relativa) indicando a quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo (g/m2/h). Este método pode detectar até mesmo a menor perturbação do de função de barreira da pele26. O pH da pele é um indicador da barreira e função antimicrobiana do SC27. A acidez do manto da pele foi medida por uma sonda de pele PH 905 (terceira) conectada à estação 5 MPA. Esta sonda especialmente projetada consiste de um eletrodo de vidro achatadas para contacto com a pele cheia, ligado a um voltímetro. O sistema de medidas possíveis alterações devido à atividade de cátions hidrogênio em torno da camada muito fina de formas semi-sólidas medido no topo da sonda. As alterações na tensão são exibidas como pH28.

Apresentamos experiências divididas em três seções: (1) preparação do KH de galinha penas por duas etapas hidrólise alcalina-enzimática e sua purificação pela diálise (remoção de sais e frações low-molecular), (2) preparação de cosméticos formulações contendo 2, 4 e 6% KH e (3) testar as propriedades de KH medindo pele, TEWL e a hidratação da pele pH. Testes foi realizado em 10 mulheres com idade média de 27,2 anos e em 10 homens com idade média de 26,2 anos. O método de seleção dos voluntários e os testes em si foram conduzidos em conformidade com os princípios éticos internacionais de investigação biomédica utilizando cobaias humanas29; todas as pessoas que deram seu consentimento antes da inclusão no estudo. Antes de testar iniciou, os voluntários foram convidados a preencher um questionário sobre seu estado de saúde. Os voluntários comprometidos com a Evite aplicar qualquer produto cosmético para os sites de teste e regiões circundantes, durante as 24 horas antes e durante o período de teste; Além disso, foram permitidos somente breve noite lavagens com água corrente.

Protocol

Voluntários foram recrutados entre os funcionários e estudantes da nossa Universidade. O método de seleção foi conduzido de acordo com “as diretrizes éticas internacionais para biomédica pesquisa envolvente cobaias humanas. Conselho para organizações internacionais de ciências médicas, Genebra (2002).” KH é um ingrediente cosmético comum usado em produtos para cabelos (xampus, condicionadores, etc.) e, portanto, não é necessária a aprovação do Conselho de revisão institucional. <p class="…

Representative Results

O KH preparado de acordo com o procedimento aqui apresentado (ver Figura 2) é amarelo na cor, facilmente solúvel em água com teor elevado de proteínas (sólidos inorgânicos representam < 2.0%); o pH da solução 1,0% de KH é 5.3 e preenche os requisitos para hidrolisados de grau cosmético. O rendimento do KH de 50 g de matéria-prima é aproximadamente 30%. A distribuição de peso molecular de KH foi determinada por SDS-PAGE e é mostrada na <strong c…

Discussion

A vantagem de hidrólise alcalina-enzimática é que ele pode ser modificado de acordo com as aplicações futuras do KH. Por exemplo, em aplicações de cosméticos capilares onde uma cor levemente acastanhada de um produto não é um obstáculo, uma temperatura mais elevada na hidrólise pode ser aplicada levando a um maior rendimento de KH. Além disso, o tempo de processamento durante as duas fases do processo tecnológico significativamente afeta o processo global de eficiência – rendimento de KH sobe para 85%.</…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este artigo foi escrito com o apoio do projeto IGA/FT/2017/007 de Tomas Bata Universidade em Zlin.

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T Novozymes LJP30020 Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L Novozymes PXN40001 Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH Sigma-Aldrich 302510289 Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4 Sigma-Aldrich W290017 Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution Sigma-Aldrich 52455 Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH Penta s.r.o. 40216 Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A) Fagron 608425 Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name Company Catalog Number コメント
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers IKA-labortechnik Z404020 Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed IKA-labortechnik R 1381 Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures Sigma-Aldrich Z371017-10EA Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9402-100FT Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD DOMO Elektronic DO42325PC Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32 Gemini bv 2770 GS1R Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device Fischer Scientific 6470.0002 Orbital shaking device
KERN 440-47N Kern 440-47N Laboratory balance
KERN 770 Kern 770 -N Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort BMT, MMM Group C 131749 Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO BMT, MMM Group B 050328 Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19 Fritsch 19.1030.00 Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5 Courage & Kazaka Electronic 10225237 MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300 Courage & Kazaka Electronic Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020 Heidolph 13-225-007-03-1 Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10 Heidolph Z336688-1EA Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12 Fagor BTT-138 Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter WTW Z313165 High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container RPC Superfos 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name Company Catalog Number コメント
Software
Microsoft Office 2010 Microsoft
C+K software Courage and Khazaka Electronic GmbH MPA 5 station operating software

参考文献

  1. United States Department of Agriculture – National Agricultural Statistics Services. . Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
  2. McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
  3. Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
  4. Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
  5. Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
  6. Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. . Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , (1968).
  7. Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
  8. Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
  9. Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
  10. Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
  11. Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
  12. Lodén, M., Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. , 107-119 (2009).
  13. Teglia, A., Secchi, G., Goddard, E. D., Gruber, J. V. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. , (1999).
  14. Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
  15. Dahms, G., Jung, A. Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. , (2014).
  16. Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
  17. Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
  18. Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
  19. Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
  20. Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
  21. Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
  22. Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
  23. Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
  24. Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
  25. Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
  26. Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
  27. Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
  28. Agache, P., Humbert, P. . Measuring the Skin. , (2004).
  29. Council for International Organizations of Medical Sciences. . International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , (2002).
  30. Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
  31. Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
  32. Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. . Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).

Play Video

記事を引用
Mokrejš, P., Huťťa, M., Pavlačková, J., Egner, P. Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics. J. Vis. Exp. (129), e56254, doi:10.3791/56254 (2017).

View Video