Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Ben Shirley; Yanxin Li; Joan H.M. Knoll; Peter K. Rogan

doi:10.3791/56245

JoVE Journal > Genetics

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遺伝学

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis

Published: September 04, 2017

doi:

10.3791/56245

Ben Shirley*¹, Yanxin Li*¹, Joan H.M. Knoll^1,2, Peter K. Rogan^1,3

¹CytoGnomix Inc., ²Department of Pathology and Laboratory Medicine,Western University, ³Department of Biochemistry,Western University

概要

El análisis citogenético cromosoma dicéntrico (DC) cuantifica la exposición a la radiación ionizante. El software automatizado de identificador de cromosoma dicéntrico y estimador de dosis con precisión y rápidamente calcula dosis biológica de DCs en las células en metafase. Distingue los cromosomas monocentric y otros objetos de DCs y calcula la dosis de radiación biológica de la frecuencia de DCs.

Abstract

Dosis de radiación biológica puede estimarse de frecuencias dicéntrico cromosoma en las células en metafase. Realizar estos ensayos citogenéticos cromosoma dicéntrico es tradicionalmente un proceso manual intensivo no muy adecuado para manejar el volumen de las muestras que requieran examen a raíz de un evento de siniestro total. Software automatizado de identificador de cromosoma dicéntrico y dosis estimador (ADCI) automatiza este proceso al examinar conjuntos de imágenes de metafase mediante técnicas de procesado de imagen basado en el aprendizaje de máquina. La selecciona software imágenes apropiadas para análisis mediante la eliminación de imágenes inadecuadas, clasifica cada objeto como una que contiene el centrómero cromosoma o no-cromosoma, más distingue los cromosomas como los cromosomas monocentric (MCs) o dicéntrico cromosomas (DCs), determina la frecuencia de DC en una muestra y calcula la dosis de radiación biológica mediante la comparación de frecuencia de DC de muestra con las curvas de calibración computadas usando muestras de calibración. Este protocolo describe el uso del software de la ADCI. Por lo general, calibración (dosis conocida) y prueba (dosis desconocida) conjuntos de imágenes de la metafase se importan para realizar la estimación de la dosis exacta. Imágenes óptimas para su análisis se pueden encontrar automáticamente mediante filtros de imagen preestablecidos o también pueden ser filtradas a través de la inspección manual. El software procesa imágenes dentro de cada muestra y frecuencias de DC se computan en los diferentes niveles de rigor para llamar a DCs, usando una máquina de aprendizaje. Curvas de calibración lineal cuadrática se generan basados en frecuencias de DC en las muestras de calibración expuestas a dosis conocidas de físicas. Dosis de prueba de las muestras expuesta a niveles de radiación inciertas se estiman a partir de sus frecuencias de DC con estas curvas de calibración. Informes pueden ser generados bajo petición y proporcionan Resumen de los resultados de una o más muestras, de una o más curvas de calibración o de estimación de dosis.

Introduction

Biodosimetry de radiación utiliza marcadores biológicos, sobre todo las aberraciones cromosómicas como translocaciones cromosómicas para medir dosis de radiación que las personas están expuestas a los cromosomas dicéntrico (DCs). Una dosis absorbida biológicamente puede ser diferente de la dosis física medida por instrumentos debido a la variabilidad entre individuos. Del mismo modo, la radiación de una cierta dosis física puede producir diferentes exposiciones biológicas debido a condiciones fisiológicas o ambientales subyacentes. Conocimiento de la dosis biológica es de particular importancia para el diagnóstico y tratamiento.

El ensayo de DC es el estándar de oro de la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Agencia Internacional de energía atómica (OIEA) para evaluar la exposición a la radiación biológica en las personas. Fue el primer ensayo recomendado por el OIEA y la OMS para la evaluación de dosis de radiación. Frecuencia de CC es relativamente estable durante aproximadamente 4 semanas después de la exposición de radiación¹ y su correlación cuantitativa con dosis de radiación emitida es exacta, que hacen DCs el biomarcador ideal. La relación entre la dosis de radiación (referenciados en unidades de Gray [Gy]) y la frecuencia de DC (se hace referencia como número de DCs por célula) puede expresarse como una función lineal cuadrática.

El análisis citogenético de DC ha sido el estándar industrial para unos 55 años². Se ha realizado manualmente, requiere 1-2 días para analizar los datos del microscopio de una muestra de sangre solo. Varios cientos a varios miles de imágenes se necesitan para estimar con precisión la exposición a la radiación dependiendo de la dosis³. En dosis superiores a 1 Gy, OIEA recomienda un mínimo de 100 DCs detectarse. Examen de 250-500 imágenes de metafase es práctica común en laboratorios citogenética biodosimetry. Para muestras con exposiciones < 1 Gy, 3.000-5.000 imágenes se sugieren debido a las probabilidades más bajas de formación de CC. En cualquier caso, es una tarea intensa de mano de obra.

Laboratorios de citogenética biodosimetry crean su propio en vitro curvas de calibración de biodosimetry de radiación antes de evaluar la dosis biológicas en muestras de prueba. Muestras de sangre de individuos normales, control están expuestas a la radiación y los linfocitos son cultivados y preparados para análisis de cromosomas de la metafase. Con estas muestras, biológicos dosis recibidas están calibrados a las conocida dosis físicas emitidas por una fuente de radiación estándar. Después de que se registran imágenes de la célula metafase, expertos examinan imágenes, contar DCs y calcular las frecuencias de DC para cada muestra. Una curva de calibración se construye ajustando una curva lineal cuadrática a las frecuencias de DC a todas las dosis. A continuación, expuestos en la muestra de individuos pueden inferirse comparando las frecuencias de DC a las dosis calibradas en la curva o si se especifica en la fórmula cuadrática lineal correspondiente.

Han automatizado tanto la detección de DCs y determinación para agilizar este procedimiento utilizando el software de la dosis. Identificador de cromosoma dicéntrico y dosis estimador (ADCI) utiliza técnicas de procesamiento de imágenes basado en el aprendizaje máquina para detectar y discriminar los cromosomas dicéntrico (DCs) de monocentric cromosomas (MCs) y otros objetos y automatiza la radiación estimación de dosis. El software pretende significativamente reducir o eliminar la necesidad de verificación manual de cuentas DC y para acelerar el cálculo de dosis mediante la automatización. Se ha desarrollado con la participación de los laboratorios de referencia biodosimetry en Health Canada (HC) y laboratorios nucleares canadienses (CNL). Sus comentarios se asegurarán de que rendimiento continuará satisfacer los criterios de la OIEA para este ensayo.

El software realiza las siguientes funciones: 1) filtrado DCs y seleccionando imágenes de célula metafase óptima para el análisis, reconocimiento de cromosoma 2), DC detección y determinación de frecuencia de DC y 3) estimación de la dosis de radiación de dosis calibrada, datos de radiación citogenética. Este software procesa grupos de imágenes de la metafase de la misma persona (llamados una muestra), cuenta el número de DCs en el uso de cada imagen de técnicas de procesamiento y devuelve la dosis estimada de radiación recibida por cada muestra en unidades de Grays (Gy).

El software ha sido diseñado para manejar una gama de estructuras cromosómicas, cuentas y densidades. Sin embargo, el algoritmo realiza óptimamente en imágenes de metafase que contiene un complemento completo cercano de cromosomas lineales, bien separados⁴. Imágenes que contienen altamente comprometidos sets de cromosomas, múltiples células, las células en metafase incompleta, hermana separación de cromátidas hermanas, núcleos, objetos no cromosómicas y otros defectos pueden reducir la precisión del algoritmo. Dedicado a modelos de selección de imagen y otros segmentación objeto umbrales pueden filtrar hacia fuera la mayoría de imágenes óptimas y DCs positivos falsos.

Detección del cromosoma dicéntrico se realiza cuando se procesa una imagen. El algoritmo intenta determinar que objetos de una imagen son los cromosomas y luego localiza las dos regiones más probables que los centrómeros de cada cromosoma. A continuación, una serie de diferentes ayuda Vector máquina (SVM) modelos de aprendizaje distinguir los cromosomas como DCs o normal, los cromosomas monocentric. Los modelos SVM difieren en sensibilidad y especificidad de detección de DC (ver paso 3.1.4 abajo), que pueden afectar a las frecuencias de DC que se determinan en una muestra.

ADCI procesos conjuntos de Giemsa (o DAPI) teñido de imágenes digitales de la metafase (en formato TIFF o JPG) para una o más muestras. El software analiza DCs en las muestras de calibración y prueba de las muestras. Las físicas dosis (Gy) de muestras de calibración son conocidos y se utilizan en la generación de una curva de calibración. Las dosis físicas y biológicas de los individuos con riesgos desconocidos se infieren por el software de la curva de calibración generada por la máquina. Aunque los laboratorios usan técnicas comparables, las curvas de calibración de diferentes laboratorios varían a menudo³. Ambas muestras de prueba y curva de calibración desde el mismo laboratorio deben ser procesados para la estimación de la dosis exacta en las muestras de prueba.

Este software ofrece velocidad, precisión y escalabilidad que direcciones la productividad necesaria para manejar un evento en el que muchos individuos simultáneamente deben ser probados. Fue desarrollado desde 2008-2017⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² ^,¹³. Utilizando hardware de ordenador recientes, este escritorioSoftware de la PC puede procesar y estimación de la dosis de radiación en una muestra de 500 equivalentes de genoma de metafase en 10-20 min ⁴. El código se basa en un sistema de segmentación de la imagen propia y algoritmos para el análisis del cromosoma de aprendizaje de máquina. Análisis experto de cada cromosoma expuesta a radiaciones Gy 3 dieron exactitudes comparables a la ADCI. En un conjunto de 6 muestras de exposiciones desconocidas (usadas previamente en un ejercicio de competencia internacional), el software calcula dosis dentro de 0,5 Gy de los valores obtenidos mediante revisión manual de los mismos datos por HC y CNL, cumpliendo con los requisitos de la AIEA para triage biodosimetry. Además, la estandarización entre laboratorios y reproducibilidad de dosis estima beneficio de tener un DC común, automatizado algoritmo de puntuación. Sin embargo, el software permite la personalización de imagen de criterios de filtrado y selección, que permite diferencias en métodos de preparación de cromosoma y las fuentes de calibración radiación a tenerse en cuenta.

Este software es una interfaz gráfica de usuario (GUI) – sistema que analiza conjuntos de imágenes de cromosomas con Giemsa (o DAPI) – tinción las células en metafase para anomalías que resultan de la exposición a la radiación ionizante. Los sistemas de imagen digital son fotografiados con un sistema de microscopio de luz (o epifluorescente) y cada juego corresponde a una muestra diferente. El software utiliza técnicas para detectar y discriminar DCs de MCs y otros objetos de procesamiento de imágenes. Filtros de segmentación derivada empíricamente entonces automáticamente eliminan falsos positivos DCs sin afectar ciertos DCs. Finalmente, el software automáticamente filtra imágenes indeseables basados en diferentes propiedades de imagen metafase de mala calidad de imágenes con los modelos de selección de imagen de las (o especificado por el usuario). Estas imágenes incluyen aquellos que contienen excesiva o insuficiente cantidad de objetos “ruidosos”, múltiples cromosomas superpuestos, imágenes faltan cromosomas de la metafase, números excesivos de la hermana chromatids⁴. Los datos de imagen automáticamente curado se utilizan para generar la curva de calibración de la dosis de muestras de dosis conocidas y se utilizan para estimar las exposiciones de prueba de las muestras expuesta a dosis desconocidas.

Salida del software puede ser visto y guardado como: salida 1) basada en textos vistos en la consola, 2) parcelas que pueden ser guardados como imágenes y 3) los informes en formato HTML. Muchos aspectos del software son personalizables para adaptarse a las necesidades específicas de diferentes laboratorios. Los laboratorios individuales generalmente proporcionan muestras de calibración y prueba preparados y recogidos basan en el protocolo citogenético validado en ese laboratorio. Esto mantiene la uniformidad de la preparación de la muestra y permite que las curvas de calibración generadas a partir de muestras de calibración para aplicarse significativo para poner a prueba las muestras derivadas usando el mismo protocolo. También pueden crear curvas de calibración de coeficientes de la curva o de frecuencias de DC a dosis definidas. Las estimaciones de dosis más exactas se obtienen por filtrar imágenes de calidad inferiores y DCs positivos falsos (FPs). Selección de subconjuntos de imagen óptima dentro de cada muestra se logra con ‘Modelos de selección de imagen’ que eliminan imágenes mediocre que tienden a introducir FPs. Una serie de modelos previamente validados se incluyen con el software, sin embargo más modelos con umbrales personalizados y filtros pueden creados y guardados, por parte del usuario.

Una vez que el software se carga correctamente, se presenta la interfaz gráfica principal de usuario (GUI) (ver figura 1). Desde esta interfaz, muestras, cada uno que consiste en una carpeta de archivos de imagen de metafase celular, puede ser seleccionado y procesada para identificar DCs, curvas de calibración pueden ser creadas y en comparación y se puede determinar la dosis de exposición de radiación de las muestras.

Figura 1: Los sectores principales de la interfaz gráfica de usuario incluir: una lista de las muestras (1), una lista de calibración de las curvas (2), el proceso de cola (3), que controla el estado de detección de DC en cada conjunto de imágenes de cada muestra, una parcela pantalla (4), que resume la estadísticas u otras propiedades cuantitativas de un conjunto de imágenes de muestras o curvas de calibración y una consola (5) que contiene un texto descriptivo como salidas de cada operación realizada por el programa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. importación y proceso de muestras clic ' muestras de ' en la barra de menú y seleccione ' nueva muestra '. Vaya a un directorio adecuado que contiene un conjunto de imágenes de la metafase y haga clic en ' Seleccionar carpeta '. Escriba un identificador único para la muestra dentro de la ' especificar un ID único para la nueva muestra ' campo de texto. Esta identificación permitirá identificar la muestra en el área de trabajo. ID de la muestra debe contener alfanuméricos, ' _ ', o '-' caracteres solamente. Inclusión del laboratorio de fuente y dosis física (para las muestras de calibración) en el ID de la muestra es conocido. (Opcional) proporciona una descripción de la muestra si se desea dentro de la ' Descripción de la muestra (opcional) ' área de texto. Clic ' OK ' para agregar la nueva muestra para el espacio de trabajo. Repetir los pasos 1.1 al 1.4 Añadir muestras adicionales. Crear un mínimo de 3 muestras de calibración (siete o más se recomiendan 3 exposiciones diferentes) y al menos una muestra para realizar la estimación de la dosis. Resaltar todas las muestras que creó en los pasos del 1.1 al 1.5 en el ' muestras de ' de la lista y haga clic en ' muestras agregar a cola de proceso ' () icono de. Clic ' procesar todas las muestras de la cola de ' () icono para procesar todas las muestras secuencialmente dentro de la cola – un ' ADCI procesamiento ' aparecerá el cuadro de diálogo que contiene todas las muestras en la cola junto a un bar de progreso Cuando todas las muestras han completado el proceso, haga clic en el . Guardar las muestras ahora, o haga clic en ' guardar una muestra procesada en un archivo de muestra de la ADCI ' () icono para guardar una muestra procesada más adelante. 2. visualización y selección de imágenes (opcional, recomendado paso) Nota: este paso describe el uso del visor de imágenes de la metafase y la creación de un modelo de selección de imagen. Algunos modelos de selección de imagen validados se incluyen con el software que puede ser utilizado en la generación de la curva de calibración y estimación de la dosis. Por lo tanto, este paso no es necesario, sin embargo puede ser utilizado como una guía que describe los pasos necesarios para hacerlo si lo desea. Resaltar una muestra dentro de la ' muestras ' lista, haga clic en ' muestras de ' en el menú de la barra y seleccionar ' imagen ' para abrir el ' metafase Image Viewer ' . Navegación entre imágenes selecciona una imagen desde el menú desplegable para ver una imagen específica. Haga clic en los iconos de flecha izquierda y derecha para desplazarse a través de imágenes. Seleccione un valor de Sigma de SVM en el menú desplegable para ver los resultados de la detección de DC en ese valor de Sigma. Seleccione " Unprocessed " desde el menú desplegable para ver imágenes raw sin contornos cromosoma. Controlar el ' invertir ' casilla de verificación invertir valores de color y el brillo de cada píxel de la imagen. Compruebe el ' imagen en lista ' casilla de verificación para añadir la imagen visible de un ' lista '. Haga clic en ' guardar la lista en un archivo de texto ' () icono para guardar los nombres de todas las imágenes en la lista a un archivo de texto. Modelos de selección de imagen clic ' ver todas las imágenes de ' (la opción por defecto) a incluir todas las imágenes en el cuadro de lista desplegable de selección de imagen. Observar el texto adyacente a ' imágenes incluidas ' descubrir la fracción de imágenes seleccionadas por el modelo de selección de imagen aplicada en la actualidad. Clic ' vista incluido imágenes ' incluir sólo estas imágenes que no han sido excluidas por el modelo de selección de la imagen en el menú desplegable. Clic ' vista excluye imágenes ' incluir imágenes que han sido excluidos por el modelo de selección de imagen aplicada en el menú desplegable. Control del ' excluir ' casilla de verificación excluir manualmente una sola imagen. Nota: Imágenes manualmente excluidas son restaurados a la imagen seleccionada si posteriormente se aplica un modelo de selección de la imagen. Guardar una selección de imágenes haciendo clic en el ' guardar selección ' botón. Introduzca un nombre de archivo de selección guardada cuando se le solicite. Haga clic en ' cargar selección ' aplicar una selección guardada anteriormente. Haga clic en ' aplicar filtros de imagen ' para abrir el ' basada en aplicar filtro de modelo de selección de imagen a muestra actual ' diálogo, que crea, guarda, o se aplica criterios de selección de imágenes de metafase en una muestra de. Seleccione un modelo de selección de la imagen de la lista precompletada. Haga clic en ' OK ' para aplicar el actual modelo. Escriba una descripción para un nuevo modelo deseado, definir ' imagen filtros de exclusión ', define ' Ranking de imagen y la inclusión ' y haga clic en ' guardar selección modelo ' para crear una imagen Selección modelo. Nota: Las definiciones de ' imagen clasificación e inclusión ' métodos y cada uno ' filtro de exclusión de imagen ' puede encontrarse en la documentación en línea de software 14. 3. Generación de la curva (Recommended optional step) curva de calibración asistente asegurar un mínimo de tres muestras de calibración están presentes en el área de trabajo antes de proceder. Haga clic en ' Wizards ' en la barra de menú y seleccione ' curva de calibración ' para abrir el Asistente de calibración de la curva de. Nota: Aunque sólo tres muestras son matemáticamente necesarias y calcular una curva de calibración, se recomiendan siete o más muestras que abarcan una gama de exposiciones entre 0 y 5 Gy. Las muestras adicionales son necesarias para adaptarse a la curva de calibración a una respuesta cuadrática lineal dosis, sin embargo los valores óptimos de la Sigma pueden ser menores con el fin de obtener las curvas que son utilizables para la estimación de dosis baja (< 1 Gy); los óptimos valores de Sigma a dosis por encima de este umbral son diferentes (consulte el paso 3.1.4). Proceder mediante el Asistente de introducción de la pantalla y seleccione la casilla al lado de cada muestra de calibración deseado. Para cada muestra de calibración seleccionado de esta manera, especificar la dosis física (en Gy) la muestra fue expuesta a dentro de su campo de texto adyacente. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. Seleccione un modelo de selección de imagen si se desea de la lista de modelos que contienen modelos de selección preestablecidos de imagen incluidos con el software además de los modelos creados manualmente. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. Seleccione un valor de Sigma de SVM en el menú desplegable. Continuar a la siguiente pantalla de Asistente para . Nota: Un valor de Sigma de SVM de 1.4 o 1.5 se recomienda para cálculos de dosis > 1 Gy y un valor de 1.0 para las estimaciones por debajo de 1 Gy ( figura 2). Revisar todo anteriores selecciones en la pantalla de Resumen y haga clic ' final ' para completar el asistente, causando un prepopulatEd ' crear una curva ' diálogo parece. figura 2: visualización del efecto de cambiar el valor de Sigma SVM desde el algoritmo el positivo verdadero (TP) y falsos positivos (FP) DC, el valor predictivo positivo (VPP) y verdadero positivo tasa (TPR). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. crear un cuadro de diálogo de curva. (Saltar este paso si se ha utilizado el asistente), haga clic en ' curvas ' en la barra de menú y seleccione ' nueva curva '. Elija ' curva de ajuste a los datos de dosis-respuesta ' desde el menú desplegable presenta en el cuadro de diálogo y haga clic ' OK '. Especificar una identidad única para la curva en el ' especificar una identidad única para la nueva curva ' cuadro de texto dentro de la ' crear una curva ' diálogo. (Opcional) tipo Descripción de la curva de nuevo dentro de la ' añadir una breve descripción de la curva crear ' cuadro de texto. (Saltar los pasos siguientes si el Asistente de curva se utilizó para crear una curva de calibración) establece los valores de la curva. Nota: El Asistente de calibración de la curva descrito en el paso 3.1 rellena los campos en la ' crear una curva ' diálogo. Los pasos siguientes describen cómo manualmente rellenar estos campos. Si se utiliza el asistente, algunos pasos se pueden todavía seguir si se desea, agregar o quitar datos adicionales. Seleccione un valor de Sigma de SVM de opciones en el ' SVM ' desplegable – se recomienda que el valor de Sigma elegido aquí coincide con el valor de Sigma elegido cuando use esta curva para realizar estimación de dosis. (Opcional) especifica un modelo de selección de la imagen haciendo clic en el ' especificar archivo ' botón. Haga clic en ' entrada ' para agregar una nueva entrada en blanco a la lista de dosis-respuesta bajo el título ' dosis respuesta de entrada de datos para crear una curva de '. Introducir la dosis de una muestra de calibración en Gy bajo el título ' dosis '. Enter ' respuesta (DC/célula) ' dibujado de salida de la muestra dentro de la consola cuando una muestra es seleccionada. Busque el valor DC celular adecuado para el valor de Sigma de SVM previamente seleccionado en la consola o desde el correspondiente informe de muestra (paso 5.1, si está disponible) y entrar en este campo. Repita los tres pasos anteriores hasta que se han añadido todas las muestras de calibración. Prensa ' datos validar ' para asegurar el contenido de la dosis de respuesta lista tiene el formato correctamente – verificar todos los campos en la lista de respuesta dosis verde resaltado indicando datos. Prensa ' OK ' para finalizar la creación de la curva. Para guardar la nueva curva en la ' guardar curva? ' cuadro de diálogo que aparece al presionar ' OK '. O haga clic en ' guardar curva a un archivo de curva ADCI ' () icono destacado dentro de la ' curvas ' lista más adelante. 4. Estimación de la dosis (Recommended optional step) Asistente de estimación de dosis clic ' Wizards ' en la barra de menú y seleccione ' estimación de dosis '. Proceder a través de la pantalla del Asistente para introducción y seleccione una curva de calibración previamente creado desde el menú desplegable – sus propiedades aparecerán a continuación. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. La casilla al lado de las muestras de prueba de exposición desconocida que lo incluyan en la estimación de la dosis. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. Observar las propiedades del modelo de selección de imagen aplicado durante la generación de la curva de calibración y descripción. Observar que el mismo modelo de selección de imagen se aplica a las muestras de ensayo. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. Nota: A continuación la descripción del modelo de selección de imagen, el mismo modelo es previamente cumplimentado y será aplicado a las muestras de prueba de selección. Aplicar el mismo modelo de selección de imagen a la calibración y las muestras de prueba. Si bien es posible aplicar modelos de selección de imagen diferente seleccionando un modelo diferente de la lista desplegable, no se recomienda esto. Seleccione un valor de Sigma de SVM en el menú desplegable. Continuar a la siguiente pantalla del Asistente para. Nota: El valor de Sigma de SVM utilizado durante la generación de la curva de calibración es previamente cumplimentado. Se recomienda que este valor modificará. Revisar las selecciones anteriores en la pantalla de Resumen y haga clic en ' final ' para completar el Asistente – una precompletada ' calculadora de dosis ' de diálogo aparecerá. Calculadora de dosis (Omita este paso si se utilizó el asistente) destacar una curva de calibración de la lista de curvas bajo el título ' curvas de ', haga clic en ' curvas ' en el menú de la barra y seleccionar ' Calcular dosis ' para abrir el ' calculadora de dosis ' diálogo. (Omitir estos pasos si el asistente se usó) establece los valores de estimación de dosis. Nota: El Asistente para la estimación de dosis descrito en el paso 4.1 rellena los campos en la ' calculadora de dosis ' diálogo. Los pasos siguientes describen cómo manualmente rellenar estos campos. Si se utiliza el asistente, algunos pasos se pueden todavía seguir si se desea, agregar o quitar datos adicionales. Clic ' Uso muestras en espacio de trabajo para cubrir frecuencias de DC ' () icono y destacar la prueba de muestras dentro de la ' las muestras procesadas en ADCI Espacio de trabajo ' lista para añadir las muestras seleccionadas para la ' DC las frecuencias para la estimación de la dosis ' lista de. Seleccionar una SVM Sigma valor e imagen modelo de selección de estas muestras de las cajas desplegables. Nota: Un valor de Sigma de SVM emparejar el valor de Sigma, utilizado en la generación de la curva de calibración es necesario para la estimación de la dosis exacta. El valor de Sigma asociado con la curva de calibración se muestra en la parte inferior de la ' dosis calculadora ' diálogo. (opcional) agregar adicional prueba de las muestras, repitiendo los dos pasos anteriores. Alternativamente, añadir múltiples muestras simultáneamente, destacando las muestras múltiples en el ' muestras procesadas en el área de trabajo ' lista de. (opcional) haga clic en el ' un valor de frecuencia de DC ' () icono para introducir manualmente un DC frecuencia no asociado a cualquier muestra si se desea – la nueva frecuencia de DC se añadirá a la ' DC las aberraciones para la estimación de la dosis ' lista de. (opcional) haga doble clic en el ' nombre ' campo de una frecuencia de DC manualmente entrada a modificar su nombre. (opcional) resaltar muestras apropiadas y haga clic en ' frecuencia DC quitar ' () icono para extraer muestras que se han añadido a la ' DC Aberraciones para la estimación de la dosis ' lista de error de. Clic ' OK ' para cerrar la ' calculadora de dosis ' y realizar la estimación de la dosis – resultados son salida a la consola. Como resultados de estimación de dosis se muestran en la consola en formato tabular para cada muestra, observar ' frecuencia DC ', ' SVM ', ' dosis estimada ' (contiene el estimado dosis biológica de la muestra en Gy), y ' modelo de selección de imagen aplicados ' campos. 5. Informes Nota: el método utilizado para un informe el nombre y seleccione un directorio en el que se guarda es común a todos los tipos de informe. A ' nombre de informe ' debe ser proporcionado. Cuando se genera un informe, se creará un directorio que contenga archivos de informe con este nombre automáticamente. Este directorio se colocará dentro es la ' Informe carpeta '. De forma predeterminada, el ' carpeta de informe ' es un directorio llamado ' informes ' en el directorio de datos especificado durante la instalación. Informe de ejemplo clic ' Informe ' en la barra de menú y seleccione ' muestra Informe ' para abrir el ' generar informe muestra ' diálogo. Introduzca un nombre para el informe en el ' nombre de informe ' campo de texto. Haga clic en ' ver ' modificar el ' carpeta de informe ' si lo desea. Seleccione al menos una muestra procesada para incluir en el informe mediante la colocación de una marca de verificación al lado de muestras adecuadas en la ' seleccionar muestras ' lista de. Especificar los valores de un rango de SVM Sigma de que generar diagramas de distribución de C.C. seleccionando valores en ' Min ' y ' Max ' desplegable cajas dentro de la ' distribución de DCs en muestra ' zona. Excluir DC distribución parcelas del informe si desea desmarcar el ' son ' casilla de verificación en la ' distribución de DCs en muestra ' zona. Especificar que parcelas que contienen estadísticas de filtrado para incluir en el informe mediante la colocación de las marcas de verificación al lado de parcelas apropiadas en la ' seleccionar parcelas ' área. Haga clic en ' OK ' para generar el informe. Informe de curva clic ' Informe ' en la barra de menú y seleccione ' curva Informe ' para abrir el ' generar informe de curva ' diálogo. Introduzca un nombre para el informe en el ' nombre de informe ' campo de texto. Haga clic en ' ver ' modificar el ' carpeta de informe ' si lo desea. Seleccione al menos una curva para incluir en el informe mediante la colocación de una marca de verificación al lado de las curvas apropiadas en la ' seleccionar las curvas que se incluirán en el informe ' lista. Haga clic en ' OK ' para generar el informe. Informe de estimación de dosis realizar medidas de estimación de dosis descritos en la sección 4. Nota: Se generan informes de estimación de dosis de los resultados indicados en las áreas de terreno y consola. Así, una parcela de estimación de dosis debe estar presente en el área de trazado en el momento que se genera un informe. Clic ' Informe ' en la barra de menú y seleccione ' informe de estimación de dosis ' para abrir el ' generar informe de estimación de dosis ' diálogo. Introduzca un nombre para el informe en el ' nombre de informe ' campo de texto. Haga clic en ' ver ' modificar el ' carpeta de informe ' si lo desea. Clic ' OK ' para generar el informe. 6. Capacidades de auditoría Nota: el software registra todas las operaciones llevadas a cabo durante una sesión en un archivo de registro. El programa proporciona una aplicación de software accesorio que permite a los archivos de registro ser visto, buscado, utiliza para evaluar la integridad de un análisis y en algunos casos recuperar datos de la muestra incompleto o prematuramente terminada sesiones. Haga clic en ' ayudar a ' en la barra de menú y seleccione ' vista registros ' para abrir el software suplementario de registro archivo espectador. Asegúrese de que los archivos de registro se muestran en la barra lateral en el lado izquierdo de la ventana. Si no hay archivos están visibles, haga clic en ' archivo ', seleccione ' directorio de archivo de registro seleccione ' y vaya a un directorio que contiene los archivos de registro de. Haga doble clic en el nombre de un archivo de registro en la barra lateral para ver el contenido del archivo de registro en el ' Viewer ' ficha Seleccionar la ' búsqueda ' ficha y entrada de búsqueda para buscar uno o más archivos de registro. Entrada de parámetros de búsqueda si lo desea en el ' de ', ' a ', ' usuario ', ' licencia ', ' funcionamiento ', y ' Parámetros ' campos. Utilice el control deslizante para seleccionar la ' resultados de la búsqueda del máximo para cada archivo '. Nota: Algunos parámetros de búsqueda, tales como nombre de usuario, devolverá muchos resultados en cada archivo de registro correspondiente. Este parámetro limita el número de resultados de búsqueda aparecen en cada archivo de registro. La casilla en la ' búsqueda destacado sólo archivos ' casilla de verificación (registro de todos los archivos se buscan por defecto) y resaltar los archivos de registro en la barra lateral para buscar sólo un subconjunto de archivos de registro de. Comprobar la ' realizar comprobación de integridad ' casilla de verificación (habilitado por defecto) para examinar cada archivo de registro de elegibles para ser buscado errores relacionados con una terminación inesperada software. Clic ' búsqueda ' buscar archivos de registro y observar la búsqueda de resultados a la derecha de la ventana. Haga clic en el ' ver archivo de registro ' botón adyacente a un resultado de búsqueda para destacar y ver la línea indicada en el ' visor ' ficha Problemas de integridad de archivo de registro haga clic en la ' integridad ' ficha para ver los errores encontrados durante la verificación de la integridad (si se pidió la verificación). Nota: Se debe realizar una búsqueda para examinar archivos de registro para cuestiones de integridad. Para realizar una comprobación de integridad sin buscar archivos de registro para uny los términos de búsqueda, simplemente deja los campos de parámetro de búsqueda negro en el ' búsqueda ' ficha, asegúrese de que los ' realizar comprobación de integridad ' está activada y haga clic en ' búsqueda '. Si se encuentran problemas de integridad, la ' integridad ' color de fondo de la ficha se convertirá en rojo Integridad de resolver problemas (salida se agrupa por el archivo de registro) donde sea posible. Nota: Para obtener más información acerca de pasos para resolver los problemas de integridad, consulte la documentación en línea 14. 7. Curva y opciones de estadísticas de estimación de dosis haga clic en ' configuración de ' en la barra de menú y seleccione ' opciones estadísticas ' para abrir el ' opciones de estadísticas ' diálogo. Seleccionar una método (mínimos cuadrados o probabilidad máxima) desde el menú desplegable de ajuste de la curva de calibración. La casilla al lado de ' pantalla IC del 95% de la curva de calibración, en su caso ' para mostrar los intervalos de confianza del 95% al trazar una curva de calibración. La casilla al lado de ' estimación de dosis calcula IC del 95% debido a Poisson ' para el cálculo de límites de confianza de 95% en las estimaciones de dosis basadas en la naturaleza Poisson de rendimiento DC. La casilla al lado de ' estimación de dosis calcula IC del 95% debido a la curva, si es aplicable ' para el cálculo de límites de confianza de 95% en las estimaciones de dosis basadas en la incertidumbre relacionada con la curva de calibración.

Representative Results

Prueba del software se realizó con datos de imagen de cromosoma metafase obtenidos de HC y CNL. Muestras de sangre fueron irradiadas por una unidad de 320 XRAD (250 kV rayos x, 12,5 mA, 2mm de filtración, tasa de dosis: 0.92 o 1,7 Gy/min) calibrado con una cámara de iones en HC y procesado en ambos laboratorios. Muestras de linfocitos de sangre periférica fueron cultivadas fijadas y teñidas en cada instalación según protocolos establecidos3,15. Imágenes de metafase de Giemsa-manchada diapositivas fueron capturadas independientemente por cada laboratorio, usando un sistema de microscopía automatizada. Expertos en cada laboratorio anotaron DCs en varias de estas muestras manualmente, construyeron sus propias curvas de calibración y calcula la dosis de prueba de las muestras de exposiciones desconocidas. Se proporciona una descripción detallada de estos conjuntos de datos en la tabla 1. Dosis físicas Propósito Preparación de HC Preparación de CNL Nombre que se refiere # de imágenes Nombre que se refiere # de imágenes 0 Gy Calibración HC0Gy 731 CNL0Gy 798 0.1 Gy Calibración HC01Gy 2162 NA NA 0,25 Gy Calibración HC025Gy 1826 NA NA 0.5 Gy Calibración HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532 0.75 Gy Calibración HC075Gy 1233 NA NA 1 Gy Calibración HC1Gy 1566 CNL1Gy 841 2 Gy Calibración HC2Gy 1147 CNL2Gy 996 3 Gy Calibración HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188 4 Gy Calibración HC4Gy 909 CNL4Gy 1635 5 Gy Calibración HC5Gy 1019 NA NA 3.1 Gy Prueba HCS01 540 CNLS01 500 2.3 Gy Prueba HCS08 637 CNLS08 500 1.4 Gy Prueba HCS10 708 NA NA 1,8 Gy Prueba HCS04 600 CNLS04 957 2.8 Gy de Prueba HCS05 1136 CNLS05 1527 3.4 Gy Prueba HCS07 477 CNLS07 735 Tabla 1: Fuentes de datos de imagen proporcionados por HC y CNL para la evaluación del Software.Nota: Modificado de la tabla 1 en Rogan et al., 20164. Sólo imágenes manualmente preseleccionados ya estaban disponibles anteriormente a nosotros de CNL. Imágenes sin filtrar se han convertido en disponibles e imagen cuentas se actualizan en consecuencia. Además, recientemente adquirió muestras HC (0.25Gy, 0.75Gy y 5Gy) se presentan aquí. Selección automática de la imagen en muestras Calidad de imagen es fundamental para la correcta detección de DC en el análisis DC. Selección de imagen por especialistas en citogenéticas se realiza manualmente en los análisis convencionales de la DC. ADCI utiliza criterios cuantitativos imagen para seleccionar automáticamente las imágenes antes de cálculo de frecuencia de DC16. Los usuarios pueden ya sea filtro de imágenes basadas en morfologías de cromosoma específico o células de la especie según la proporción relativa de longitudes de objetos de acuerdo a longitudes conocidas de grupos definidos por citogenética de los cromosomas en un cariotipo humano normal (llamado el método de la distancia de grupo-bin). Los filtros morfológicos disponibles utilizan umbrales de escala invariante para rechazar imágenes de celular con conjuntos de cromosomas incompleto o con múltiples metafases, con cromosomas Prometafase, con hermana prominente disociación de cromátidas hermanas, muy doblado y retorcido cromosomas, con objetos que tienen contornos suaves característicos de núcleos intactos y los que menos objetos se reconocen como los cromosomas. Figura 3 (a) y (b) ejemplos de imágenes seleccionadas, considerando que la figura 3 (c) y (d) son ejemplos de imágenes que se filtran por el software. Estas imágenes se derivan de la muestra HCS05 (descrito en la tabla 1) y son seleccionadas por el modelo de selección de imagen predefinidos que alinea todas las imágenes por la distancia de grupo bin, luego selecciona las mejores imágenes de 250. Cromosomas en figura 3 (A), (b) están bien separadas y exhiben morfología satisfactoria. Figura 3 (c) contiene un número excesivo de racimos traslapados del cromosoma. Figura 3 (d) muestra hermana severa separación de cromátidas hermanas. Cromátida hermana está completamente separado por al menos 8 de los cromosomas y la constricción centromérica es ambiguas en la mayoría de los otros cromosomas. Figura 3: ejemplos de imágenes de metafase en muestra HCS05 (ampliación: 63 X), Unselected y seleccionadas por el modelo ‘Grupo Bin distancia, Top 250 imágenes’. (A) y (B) son imágenes seleccionadas. (C) y (D) son imágenes que han sido eliminados por el modelo. (C) fue excluido porque contenía demasiados cromosomas superpuestos y (D) tenía un número excesivo de hermana separada cromátides hermanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los efectos de la aplicación de estos modelos de selección de la imagen es evidente al examinar el nivel de confianza de la detección de DC en una muestra. Ocurrencias de DCs en una población de células de una muestra irradiada siguen una distribución de Poisson. La prueba de bondad de ajuste ji-cuadrada compara la distribución de frecuencia observada de DC para el esperado ajuste a la distribución de Poisson. Valores derivan de modelos en que correctamente datos de muestra filtro exhiben frecuencias de DC no significativamente diferentes de la esperada Poisson (nivel de significancia por lo general > 0.01). Figura 4 muestra las ocurrencias de DC y los correspondientes ajustes a distribuciones de Poisson para la muestra de HC4Gy de todas las imágenes vs sólo imágenes seleccionadas por el modelo de “distancia de grupo bin, superior 250 imágenes”. Figura 4 (b) muestra un mejor ajuste a la distribución de Poisson. El p-valor (0.36) de la serie filtrada de imágenes supera significativamente de la distribución de DC sin filtrar en la figura 4 (a). En 5%, o niveles de significancia de 1%, la muestra sin filtrar en la figura 4 (a) es menos confiable, porque contiene datos de DC de inferior calidad, como la hipótesis nula de una distribución de Poisson de DCs es rechazada. Figura 4: Imágenes de frecuencias de DC proporcional ajuste para Poisson Dstributions de HC4Gy de la muestra en el Software. (A) todas las imágenes son incluidas, (B) sólo se incluyen imágenes seleccionadas por el modelo (grupo bin distancia, imágenes de top 250). La leyenda (parte superior derecha) indica la estadística del ajuste a la distribución de Poisson (índice de dispersión, prueba de Mu y Lambda) y la ji cuadrado prueba de bondad de ajuste (p-valor) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Detección del cromosoma dicéntrico (DC) Detección precisa de DC es el requisito requisito crítico de la ADCI. Correctamente detectados DCs y las perdidas por el software se definen respectivamente como verdaderos positivos (TPs) y falsos negativos (FNs). Objetos que no sean DCs, pero detectaron incorrectamente como DCs, se denominan falsos positivos (FPs). FPs son monocentric cromosomas, fragmentos de cromosoma, separados de la hermana cromátides, cromosoma comprometidos grupos y objetos no cromosómicas. La figura 5 muestra los resultados de detección de DC en dos imágenes de la metafase. Los objetos 1 y 3 son TPs, y objeto 4 es un FP compuesto por dos cromosomas distintos monocentric, sumados a lo largo de sus brazos cortos. En la figura 5 (a), objeto 2 fue originalmente un FP, pero corregida posteriormente por filtros FP en el software. Objeto 5 y objeto 6 en la figura 5 (b) son probablemente ejemplos de FNs. Figura 5: Capturas de pantalla indican la clasificación de cromosomas de la metafase de (A) potencial de DCs. Una imagen de muestra CNL1Gy (ampliación: 63 X) mostrando 1 TP, objeto “1”; y 1 corregir FP, objeto “2”. (B) una imagen de muestra CNL4Gy (ampliación: 63 X) mostrando 1 TP, objeto “3”; 1 FP, objeto “4”; y 2 potenciales FNs, objetos “5” y “6”. TPs, FPs corregida, monocentric normal y sin clasificar cromosomas respectivamente se contornean con contorno rojo, amarillo, verde y azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Estimación de dosis de prueba de las muestras El resultado final del análisis de la ADCI son estimaciones de la dosis de muestras deducidas de las curvas de calibración. Estimaciones de dosis hechas por el software para las muestras de prueba en la tabla 1 se indican en las tablas 2 y 3. Para la comparación, la dosis de radiación física emitida y se indican las dosis anotadas manual por expertos en HC para muestras HCS01, HCS08 y HCS10. Del mismo modo, la física y manual anotadas dosis por expertos CNL aparecen para CNLS04, CNLS05 y CNLS07. Figura 6 muestra las curvas de calibración con las estimaciones de dosis de radiación para muestras de laboratorio de biodosimetry de salud de Canadá HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 y HCS07. La curva de calibración se genera utilizando muestras de HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy y HC4Gy. El modelo de selección de imagen que contienen filtros basada en Z-score 3 + “grupo bin distancia, imágenes de top 250” se aplica a todas las muestras. Estimaciones de dosis junto con análisis estadísticos asociados se muestran en la tabla 2. Figura 6: Captura de pantalla de estimación de dosis de prueba de las muestras de HC. Casillas negras representan las muestras de calibración. Imágenes de muestras de prueba y calibración son seleccionados por el modelo (3 filtros FP + grupo bin distancia, superior 250 imágenes). Grosor de las líneas de puntos representan la asignación de DCs/metafase a través de la curva de calibración a dosis estimada. Delgadas líneas punteadas denotan superior e inferior 95% límites de confianza de DCs/metafase. Códigos de prueba de las muestras de color: rojo brillante, HC S01 (dosis física: 3.1Gy, dosis HC inferida: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); verde oscuro, HC S04 (dosis física: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); azul brillante, HC S05 (dosis física: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); azul oscuro, HC S07 (dosis física: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); rojo oscuro, HC S08 (dosis física: 2.3Gy, dosis HC inferida: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); verde brillante, HC S10 (dosis física: 1.4Gy, dosis HC inferida: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestras Dosis físicas HC inferir dosis ADCI estima dosis Dosis estimada LCL Dosis estimada UCL P-valor * HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117 HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815 HCS10 1.4 1.4 0.95 0.5 1.55 0.211 HCS04 1.8 NA 1.85 1.25 2.55 0.0293 HCS05 2.8 NA 2.95 2.25 3.75 0.00354 HCS07 3.4 NA 2.35 1.7 3.1 0.0002 Tabla 2: Dosis de estimación de resultados de muestras de prueba HC.Nota: Modificado de tabla 3 de Rogan et al., 20164. ADCI dosis estimaciones previamente se basan en las imágenes sin filtrar y ajuste de curvas se realizó mediante el método de mínimos cuadrados. Aquí, la curva de calibración se ajustó utilizando el método de máxima verosimilitud y se aplicó un modelo de selección de imagen que contiene 3 filtros FP + “grupo bin distancia, imágenes de top 250” antes de estimación de dosis. Dosis estimada UCLy LCL para estimación superior de la dosis y reducir límites de confianza de 95% según la naturaleza de Poisson de rendimiento de DC. * Bondad cuadrado chi de ajuste a la distribución de Poisson teórica; NA: No se proporcionaron resultados de dosis manualmente inferido. Dosis de radiación se estima para las muestras de CNLS04 de laboratorios nucleares canadienses, CNLS05, CNLS07, CNLS01 y CNLS08 se muestran en la figura 7. La curva de calibración se genera utilizando muestras de CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy y CNL4Gy. Aplicamos un modelo de selección de imagen que consta de 6 filtros FP para todas las muestras. Los resultados con los análisis estadísticos se muestran en la tabla 3. Figura 7: Captura de pantalla de estimación de dosis de prueba de las muestras de CNL. Casillas negras representan las muestras de calibración. Imágenes de muestras de prueba y calibración son seleccionados mediante filtros FP 6. Grosor de las líneas de puntos representan la asignación de DCs/metafase a través de la curva de calibración a dosis estimada. Delgadas líneas punteadas denotan superior e inferior 95% límites de confianza de DCs/metafase. Códigos de prueba de las muestras de color: rojo brillante, CNL S04 (dosis física: 1.8Gy, dosis CNL deducido: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); rojo oscuro, CNL S05 (dosis física: 2.8Gy, dosis CNL deducido: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); verde brillante, CNL S07 (dosis física: 3.4Gy, dosis CNL deducido: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); verde oscuro, CNL S01 (dosis física: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); azul, CNL S08 (dosis física: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestras Dosis físicas CNL deducido dosis ADCI estima dosis Dosis estimada LCL Dosis estimada UCL P-valor * CNLS04 1.8 1.7 1.95 1.25 2.45 0.0545 CNLS05 2.8 2.7 3.05 2.75 3.35 0.325 CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3.75 0.473 CNLS01 3.1 NA 3.75 3.35 > 4 7.63E-11 CNLS08 2.3 NA 2.8 2.25 3.3 0.777 Tabla 3: Muestras de ensayo resultados de estimación de dosis de CNL.Nota: Modificado de la tabla 3, Rogan et al., 20164. ADCI dosis estimaciones previamente fueron basadas sin filtrar (HC) o manualmente seleccionaron imágenes (CNL) y ajuste de curvas se realizó mediante el método de mínimos cuadrados. Aquí, la curva de calibración se ajustó utilizando el método de máxima verosimilitud y se aplicó un modelo de selección de imagen que contiene 3 filtros FP + “grupo bin distancia, imágenes de top 250” antes de estimación de dosis. Dosis estimada UCL y LCL, respectivamente, consulte dosis estimada superior e inferior límites de confianza de 95% según la naturaleza de Poisson de rendimiento de DC.* Bondad cuadrado chi de ajuste a la distribución de Poisson teórica; NA: Resultados de dosis manualmente inferido no estaban disponibles. Estimación de dosis de radiación dentro de la gama linear de la curva de calibración (< 1 Gy) se puede realizar con el software, sin embargo es un Sigma se recomienda el valor de 1.0 para reducir aún más la frecuencia de DCs erróneamente (figura 8). Figura 8: Imágenes de dos curvas de calibración derivan de las muestras de calibración de HC en Sigma diferentes valores. (A) las muestras de calibración de HC: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy y 5Gy en Sigma = 1.5. (B) muestras de calibración de HC: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, y 5Gy usando SVM Sigma = 1.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Estos análisis indican que existen pequeñas, pero aceptables diferencias entre dosis física y biológicamente inferido interpretaron por expertos y por el software. La diferencia entre manual o software de estimación de la dosis física se conoce como el “error”. El error en las dosis inferidas de las muestras manualmente marcadas por HC y CNL es ≤0. 3 Gy. Tratamiento automatizado por el software es menos preciso que los expertos, pero generalmente dentro de los límites especificados por el OIEA triage de ± 0,5 Gy3. Para la mayoría de las muestras de prueba en las tablas 2 y 3, el software produce resultados correctos dentro de este umbral. Sin embargo, HCS07 y CNLS01 muestran un pobre bondad de ajuste a la distribución de Poisson, lo que sugiere que hubo problemas en imagen y calidad de DC en estas muestras que no fueron resueltos por aplicación de la imagen y modelos de selección del punto de congelación. El umbral de significación de p valor parece ser demasiado rigurosos en el caso de HCS05, donde el software determina con precisión la dosis correcta.

Discussion

Posibilidades y limitaciones del software

El protocolo descrito en este artículo presenta el procedimiento paso a paso típico utilizado en ADCI para importar y procesar imágenes citogenéticas metafase, crear radiación curvas de calibración y estimar dosis biológicas en individuos o muestras expuestas a desconocido niveles de radiación. Sin embargo, no es necesario llevar a cabo estas instrucciones secuencialmente. Por ejemplo, muchas muestras de la prueba de dosis desconocida pueden ser procesadas y analizan usando la misma curva de calibración de las. Además, una vez finalizado el proceso, la selección de la imagen y DC filtrado de modelos pueden ser iterado por el usuario. Aplicación de un modelo de selección de imagen apropiada depende de las características y calidad de los datos de imagen de metafase, que a su vez se basa en el protocolo de laboratorio utilizado para preparar las células y los criterios de rigor utilizados para seleccionar las celdas con automatizado sistemas de captura de metafase. Morfologías cromosoma diferirá entre biodosimetry y laboratorios de citogenéticos, y por lo tanto, los modelos de selección de imagen deben ser evaluados por el usuario para determinar si los modelos de selección de imagen predefinidos suministrados con el software serán adecuados para producir estimaciones de dosis exacta, o si custom modelos con definidas por el usuario umbrales deben ser creado. Basándonos en nuestra experiencia, la eficacia de los modelos de selección de imagen está influenciada por la fuente y la calidad de las imágenes de la célula. Los usuarios pueden diseñar sus propios criterios de selección de imagen utilizando diferentes combinaciones de filtros para eliminar falsos positivos DCs modelos de selección de imagen y los correspondientes valores de umbral para seleccionar imágenes que desee. Hay flexibilidad en la entrada de las curvas de calibración y estimación de la dosis, como coeficientes de la curva lineal cuadrática y de frecuencias de DC pueden ser modificados o introducidos manualmente.

Aunque el software es completamente automatizado, imágenes pueden ser manualmente revisadas y seleccionadas. Esta capacidad está disponible para incluir o eliminar imágenes procesadas individualmente a través de la función de visor del microscopio en el GUI principal. Sin embargo, debido a la automatización, el software es significativamente más eficiente en comparación con el manual de puntuación de las imágenes de la metafase y contando DCs. Una muestra compuesta de 1000 imágenes puede procesarse en 20 (tiff) a 40 minutos (jpg) en una estación de trabajo rendimiento de núcleos múltiples. Este software será particularmente útil en situaciones de tiempo crítico o mano de obra intensiva, como los eventos en que varios individuos han estado expuestos o se sospecharon que han sido expuestos a la radiación, o donde tiempo-sensible el diagnóstico y tratamiento las decisiones son fundamentales.

Detección precisa y exacta de alto rendimiento de DCs, así como estimación de la dosis son necesarios para la evaluación de la radiación sin vigilancia. Otras alternativas disponibles para el software no cumplen con estos requisitos. Un análisis citogenético asistida de usuario, basados en imágenes (DCScore, Metasystems¹⁷) sistema requiere verificación manual de DCs de candidato, debido a un error alta tasa atribuible a sin corregir solapamientos entre los cromosomas y el sistema no determina dosis de radiación. DCScore no sería tan eficaz como la ADCI en un acontecimiento de la radiación que implica a un gran número de personas potencialmente expuestas. Sistemas de abertura grande microscopio pueden recoger imágenes de múltiples células de la metafase¹⁸, sin embargo, ellos no analizarlos. “CABAS”¹⁹ y “Estimar la dosis”²⁰ software pueden generar calibración curvas y estimación de la dosis, pero no score DCs. Otros ensayos de biodosimetry que no se basan en el análisis DC incluyen H2AX fluorescencia, fluorescencia en situ hibridación con ADN sondas dirigidas a ciertos cromosomas, genes, ensayo del micronúcleo y orina y respiratorio. Estos métodos son menos específicos y sensibles para radiaciones ionizantes, pueden ser más costosos, en algunos casos, son más lentos y generalmente no se han estandarizado a través de varios laboratorios de referencia. La mayoría de estas técnicas no detectan radiación estable de respuestas, por lo que no se puede utilizar para la evaluación de largo plazo (> post exposición de 7 días) de dosis de radiación. Por el contrario, esto puede evaluar a personas hasta a la exposición después de 90 días y puede procesar datos de cualquier microscopio de laboratorio de citogenética sistema de imagen. Sin embargo, si se extrae una muestra de > 4 semanas posterior a la exposición, sensibilidad se reduce debido a la decadencia de las aberraciones dicéntrico¹^,²^,³ y el software actualmente no corregir las frecuencias de DC por los retrasos en el muestreo individuos expuestos.

Este software tiene algunas limitaciones. Modelos de selección de imagen existentes seleccione sobre todo imágenes de metafase aceptable, pero en algunos casos, no eliminar imágenes insatisfactoria, que pueden reducir la precisión en la detección de DC. Sigue siendo una pregunta abierta cómo diseñar un modelo de selección de imagen satisfactorio que elimina todas las células en metafase inadecuados. El software proporciona estimaciones precisas para las muestras expuestas a dosis más altas de radiación (≥ 2 Gy). A pesar de progresos considerables en la reducción del número de falsos positivos de DCs¹⁶, estos objetos no han sido eliminados. Reducir las células en metafase calidad en dosis bajas de radiación (especialmente < 1 Gy) son más propensos a detecciones positivas falsas de la DC. Por lo tanto, las muestras de baja dosis no se incluyeron al generar la curva de calibración utilizada para la estimación de la dosis de prueba de las muestras de HC. Si se desea una curva que contiene muestras de dosis baja, un valor más bajo de la SVM Sigma reduce cuentas falsos positivas en muestras de baja dosis pero puede resultar en un menor rendimiento de DC en muestras de alta dosis. Figura 8 se compara la curva HC utilizada para la estimación de la dosis (Sigma = 1.5) con una curva de calibración ajuste con muestras adicionales de dosis baja en el valor de sigma menor de SVM (1.0). En muestras con un número insuficiente de células de la metafase o imágenes de metafase de mala calidad, no puede ser posible estimar precisamente los riesgos biológicos en dosis baja, potencialmente resultando en desviaciones de dosis físicas exceda 0,5 Gy.

El software no puede valorar con precisión los tipos de radiación Si sus curvas de dosis-respuesta mejor ajustan un modelo lineal o casi lineal. Hasta el momento, ha sido probado solamente con las muestras expuestas a rayos Gamma y X. Si se examina otra fuente de radiación, los usuarios garantizarán muestras de calibración y prueba están expuestas al mismo tipo de radiación. El software usa máxima verosimilitud o mínimos cuadrados para construir una curva dosis-respuesta utilizando un modelo lineal cuadrática. Hay actualmente ninguna opción de imponer una curva lineal estricto ajuste, apropiado para exposiciones de partículas de alta energía, sin embargo dicha funcionalidad estará disponible en el futuro.

Desarrollo futuro

Nuestros esfuerzos se centran en la mejora de modelos de selección de imagen y medición precisa de la dosis, en particular de las muestras expuestas a dosis bajas de radiación. Versiones posteriores de software proporcionará medidas de error estándar en las estimaciones de dosis e intervalos de confianza en las curvas de calibración. Además, una versión high-performance computing del software para la supercomputadora gen azul (BG/Q, IBM) está en desarrollo para la evaluación oportuna de individuos expuestos en un evento de radiación de baja masa. Algunos de los componentes del software ya han sido probados y desplegados en esta plataformaLass = “xref” > 11.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dr. Ruth Wilkins, Radiobiología y protección en salud de Canadá y Farrah Flegal, laboratorios nucleares canadienses y su personal de laboratorio para el acceso a los datos de imagen de metafase de los laboratorios de citogenética biodosimetry. Este trabajo fue apoyado por un contrato de construcción en Canadá programa de innovación para CytoGnomix (no. de serie EN579-172270/001/SC). La versión inicial de la ADCI y desarrollo de algoritmos fueron apoyados por el fondo de innovación occidental; las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (NSERC Discovery Grant 371758-2009); Servicio de salud pública de los Estados Unidos (DART-dosis CMCR, 5U01AI091173-0); la Fundación Canadiense para la innovación; Cátedras de investigación de Canadá y CytoGnomix Inc.

Materials

Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI)	CytoGnomix	NA	ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei	Examples: Metasystems, Leica Microsystems	M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software	High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63x magnification objective, 10x magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional)	Micro-Star International	MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro	Multi-core performance workstation.

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記事を引用

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis