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生物学

Enregistrement en temps réel In Vivo des signaux calciques Arabidopsis pendant la tétée insectes à l’aide d’un biocapteur Fluorescent

Published: August 15, 2017
doi:
10.3791/56142
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1Department of Metabolic Biology,John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Botany,University of Wisconsin, Madison, 3生化学・分子生物学科,Saitama University, 4Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO),Japan Science and Technology Agency (JST), 5Department of Cell and Developmental Biology,John Innes Centre, Norwich Research Park

概要

Ce protocole décrit une méthode simple pour analyser les signaux calciques chez les plantes générées en se nourrissant d’insectes hémiptères, comme les pucerons. Arabidopsis thaliana transformée avec le biocapteur de calcium GFP GCaMP3 permettant l’imagerie en temps réel en vivo de dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Abstract

Les ions calcium sont prévues pour être des entités de signalisation clées lors des interactions biotiques, avec signalisation calcique formant partie intégrante de la réaction de défense de plante éliciteurs microbiennes et blessant causée par mâcher des insectes, suscitant calcium systémique signaux chez les plantes. Cependant, le rôle du calcium dans vivo durant le stress biotique est encore incertain. Ce protocole décrit l’utilisation d’un capteur de calcium codé génétiquement pour détecter les signaux calciques chez les plantes lors de l’alimentation par un hémiptère parasite. Hémiptères tels que les pucerons percent un petit nombre de cellules avec spécialisé, allongée sucer des pièces buccales, rendant l’outil idéal pour étudier la dynamique du calcium lorsqu’une plante est confrontée à un stress biotique, qui se distingue par une réponse blessant. En outre, les biocapteurs fluorescents révolutionnent la mesure de la signalisation des molécules in vivo chez les animaux et les plantes. Exprimant un biocapteur GFP-basé de calcium, GCaMP3, dans la plante modèle Arabidopsis thaliana permet l’imagerie en temps réel de la dynamique du calcium végétale au cours de l’insecte, alimentation, avec une haute résolution spatiale et temporelle. Un test fiable et reproductible a été développé à l’aide de la microscopie de fluorescence de feuilles détachées de GCaMP3, permettant la mesure en continu de la dynamique de calcium cytosolique avant, pendant et après la tétée insectes. Cela révèle une élévation du calcium rapide très localisée autour du site qui se produit en quelques minutes de pucerons. Le protocole peut être adapté à d’autres stress biotiques, telles que d’autres espèces d’insectes, tandis que l’utilisation de l’Arabidopsis thaliana permet la génération rapide de mutants pour faciliter l’analyse moléculaire du phénomène.

Introduction

Calcium (Ca2 +) est un des éléments plus omniprésentes signalisation chez les plantes. Une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 + cytosolique ([Ca2 +]cyt) est décodé par un réseau complexe de composants en aval et est impliqué dans la réponse à ces deux contraintes abiotiques et biotiques1,2. Une augmentation de [Ca2 +]cyt est l’une des premières réponses aux éliciteurs microbiennes, formant une partie commune de l’usine défense réponse3,4,5. S’élève à [Ca2 +]cyt a aussi observé en réponse aux blessures causées par la mastication des insectes tels que les lépidoptères6,7. Cependant, le rôle potentiel des plantes Ca2 + signaux en réponse aux menaces biotiques qui endommagent seulement quelques cellules en direct n’a pas été explorée. Le puceron vert du pêcher Myzus persicae est un insecte hémiptère qui représente une menace importante pour le monde agricole8,9, et Ca2 + l’efflux de l’espace extracellulaire a été observée dans les feuilles infestée de M. persicae10. Cette présente protocole, une méthode fiable et reproductible pour mesurer les plantes Ca2 + signaux tandis que M. persicae se nourrissent des feuilles en utilisant un fluorescent Ca2 + biocapteur, pucerons et GCaMP3 offre de nouveaux outils permettant de disséquer le rôle du Ca2 + au cours d’interactions biotiques.

Ca2 +-microélectrodes étaient autrefois utilisés pour mesurer [Ca2 +] plantes11,12. Plus récemment, des approches bioluminescentes et fluorescents ont devenu normalisés. Ces biocapteurs lier Ca2 + et émettent de la lumière, ce qui permet des possibilités non parallèles à étudier Ca2 + dynamique dans les cellules et les tissus entiers. Ca2 + biocapteurs peuvent être injectés comme colorants ou stablement produites lors de l’introduction du biocapteur codage dans le génome de l’organisme par l’intermédiaire de transformation (c.-à-d., codé génétiquement biocapteurs). Ce dernier offre les principaux avantages d’être facilement exprimés dans des tissus vivants et capables de localisation sous-cellulaire13. La protéine aequorine, isolée de Aequorea victoria (méduses) a été le premier génétiquement encodé Ca2 + biocapteur déployé en plantes14. Comme une protéine bioluminescente, aequorine ne nécessite pas d’excitation par la lumière extérieure, ce qui évite le chromophore de blanchiment et autofluorescence15. Aequorine a été utilisé avec succès pour mesurer les flux [Ca2 +] en réponse à divers stimuli, y compris la température16, agents pathogènes17,18,19, sel stress20 ,21et blessant7. Toutefois, il est pénalisé par l’intensité du signal relativement faible, ce qui rend la détection des flux [Ca2 +] dans des cellules individuelles et des tissus avec capteur mauvaise expression difficile13.

Le développement de Ca2 + biosenseurs qui peuvent réagissent en a complété l’aequorine en tenant compte de l’analyse détaillée de subcellulaire et au niveau du tissu de Ca2 + dynamique. Un des plus communs biocapteurs fluorescents sont le transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET)-base de Cameleons. Cameleons frette sont composées de deux protéines, généralement de PCP et YFP, qui sont mis en contact étroit par le changement conformationnel induit par la liaison du Ca2 + à un domaine calmoduline dans la région d’éditeur de liens de PCP-YFP. Ce contact permet le transfert d’énergie de PCP YFP et le changement résultant de la fluorescence de ces fluorophores permet la quantification précise de [Ca2 +] au moyen du calcul du rapport entre les signaux de fluorescence des deux fluorophores22. Cameleons frette sont supérieurs aux colorants fluorescents aequorine et non-ratiométrique, car ils sont que moins affectés par le niveau d’expression de la protéine23 et ont souvent un meilleur rendement fluorescent, permettant d’imagerie cellulaire et subcellulaire23. Par exemple, frette Cameleons ont été récemment utilisés pour identifier des signaux sur de longues distances de Ca2 + chez les plantes et pour résoudre ces cellulaires niveau24,25,26.

Une percée récente avec fluorescente GFP-autorité de certification2 + biocapteurs a été le développement de biocapteurs ultrasensibles single-fluorophore (single-FP). Single-FP biocapteurs sont constitués d’un seul circulairement permuté GFP liée à une calmoduline et M13 peptide, avec Ca2 + lie à la calmoduline, ce qui entraîne une réaction induite par l’eau entre la calmoduline et GFP alors quant à protoner GFP et augmentation fluorescent de rendement27,28,29. Single-FP capteurs offrent plusieurs avantages par rapport à frette Cameleons, y compris la conception expérimentale plus simple et une résolution temporelle potentiellement plus élevée d’imagerie30. Bien que simple-FP capteurs ne peut pas quantifier absolue [Ca2 +] aussi simplement comme capteurs de frette, qu’ils sont supérieurs pour les signaux de l’analyse de la dynamique temporelle et spatiale de Ca2 + 5,23. GCaMPs sont l’un des plus simple-FP capteurs28 et ont subi plusieurs révisions afin d’améliorer leur rendement fluorescent, gamme dynamique, Ca2 + affinité et les rapports signal sur bruit31,32 , 33 , 34. the GCaMPs ont été utilisés avec succès dans les systèmes animaux, tels que fruits et poisson-zèbre motoneurones35 voler des jonctions neuromusculaires,34. Mutagenèse aléatoire de GCaMP3 a entraîné des classes supplémentaires de single-FP capteurs, y compris l’ultrasensible GCaMP636 et le GECOs29. Les GECOs ont été dernièrement mises chez Arabidopsis thaliana (désormais dénommé Arabidopsis) pour mesurer les Ca2 + flux en réponse à l’ATP, chitine et la flg22 bactérienne éliciteur. Cette étude a également démontré que le biocapteur R-GECO a surpassé la frette Cameleon YC3.6 en termes de signal maximal changement et signal-bruit ratio5.

En raison de la facilité d’utilisation, fluorescentes à haut rendement et haute résolution temporelle qui peut être réalisée avec GCaMP biocapteurs, GCaMP3 a été codé génétiquement chez Arabidopsis sous le promoteur 35 s du virus de mosaïque de chou-fleur . Les outils génétiques disponibles pour la recherche de l’Arabidopsis permettent l’analyse moléculaire détaillée du Ca2 + signal mesuré par GCaMP3. En outre, le biocapteur de GCaMP3 peut être visualisé sous un microscope à fluorescence, plutôt qu’un système confocal plus coûteux. Ce protocole permet d’ensemble-imagerie, indispensable lorsqu’il procède à des expériences avec des stress biotiques direct des tissus. L’expérience est conçue tel que des feuilles détachées de 35S::GCaMP3 plantes sont flottait dans l’eau, pour empêcher la fuite insecte et de restreindre l’alimentation à un tissu spécifique. La méthode décrite dans cet article permet donc l’analyse de la feuille Ca2 + dynamique pendant la tétée de M. persicae, ayant pour résultat la caractérisation d’une plante nouvelle réponse de signalisation. Cette méthode peut également être adaptée pour travailler avec les autres contraintes biotiques, comme les autres espèces d’insectes et d’agents pathogènes microbiens et autres tissus végétaux, comme les racines.

Protocol

1. préparation de l’usine (jours 1 – 4) le jour 1, stériliser 35S::GCaMP graines à l’aide de trois lavages d’éthanol 75 %, 1 minute par lavage et plaque sur 100 mm 2 square assiettes en plastique avec ¼-force Murashige et Milieu Skoog (MS) (recette : 1,1 g de milieu de Murashige et Skoog, 7,5 g de saccharose, 10 g d’agar Formedium et 1 L d’eau déionisée) 37. Stratifier les semis dans l’obscurité pendant trois jours à 8 ° C pour obtenir une germination synchrone. Le jour 4 de l’expérience, déplacer les semis de GCaMP dans une chambre d’atmosphère contrôlée (CER) à 23 ° C, avec une photopériode sombre lumière et 8 h de 16 h. 2. Insecte élevage (jours 11 – 12) le jour 11 de l’expérience, ajouter 15 adultes M. persicae à 5 semaines Arabidopsis plantes en terre à l’aide d’un artiste humide ' pinceau s (taille 2 ou 4) (cultivé dans une région d’exécution limitée à 22 ° C, avec 10 h lumière et 14 h photoperio foncé d). Cage les pucerons sur la plante en plaçant le tube en plastique transparent (10 x 15 cm) autour de la plante et le bouchon avec un couvercle en plastique. Laisse les plantes infestées de pucerons pendant 24 h dans une zone CER à 22 ° C avec un 16 h lumière et la photopériode foncé de 8 h. Au jour 12 de l’expérience, enlever tout adulte M. persicae à l’aide d’un pinceau. NOTE : Insectes peuvent être vu par les yeux sur la plante. Cela donne une population de nymphes avec un âge de développement similaire. Environ 1 nymphe par adulte se produiront au cours de cette période. Laisser les plantes infestées dans un CER basse température à 16 ° C, avec un 8 h lumière et 16 h foncée photopériode, pour empêcher les nymphes d’augmenter en taille trop rapidement. 3. Feuille de détachement (19 jours) le jour 19 de l’expérience, enlever les semis de 35S::GCaMP3 de la CER et détacher la plus grande feuille de chaque plante à l’aide d’une paire de ciseaux pointus. à l’aide d’une paire de pincettes, placer la feuille détachée dans le puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 µL d’eau distillée, abaxiale vers le haut. Répéter pour feuilles supplémentaires ( Figure 1). figure 1 : test de feuille de 35S::GCaMP3. La plus grande feuille de chaque plant d’Arabidopsis 16 jours 35S::GCaMP3 est détachée et flottait sur 300 µL d’eau distillée dans une plaque à 96 puits. Photo prise le lendemain du détachement. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. couvrir la plaque dans la pellicule de plastique clair et papier d’aluminium et laisser à température ambiante pendant la nuit pour permettre le stress du détachement à se calmer. 4. microscopie en fluorescence (jours 20 – 22) 20e jour de l’expérience, retirer le papier d’aluminium de la plaque à 96 puits et transférez-le vers un stéréomicroscope de fluorescence. Configurer le microscope de fluorescence stéréo pour exciter la GFP à un 450-490 nm et de capturer l’émission fluorescente entre 500 et 550 nm. Recueillir les pucerons âgés de la colonie établie le jour 11 de retirer la plante du sol et en le plaçant dans une boîte transparente avec couvercle. Garder les insectes contenues dans la boîte tout en menant l’expérience. Placer la plaque à 96 puits sous le microscope. Modifier l’exposition à la lumière jusqu’à ce que la fluorescence GCaMP3 peut être clairement visualisée dans les veines des feuilles détachées. Maintenir l’exposition constante pour toutes les expériences ; pour le protocole actuel, une exposition de 1 s a été utilisée avec un gain de 3.5 ( Figure 2). Régler le zoom du microscope et un grossissement de sorte que 4 puits peuvent être observés dans une image ; pour le protocole actuel, a été utilisé un 7,8 X grossissement et un objectif de mm-127,8330. Transférer un puceron sur une feuille détachée au microscope à l’aide d’un pinceau humide. Laissez une feuille adjacente n’est pas traitée comme un contrôle, mais légèrement le toucher avec le pinceau pour imiter les attouchements qui se produit pendant le transfert de pucerons. N’oubliez pas de placer l’enveloppe en plastique en haut de la plaque à 96 puits au cours de la microscopie pour empêcher les insectes de s’échapper. Commencer l’enregistrement de la fluorescence des feuilles en paires (1 imprégnées d’insecticide puceron et 1 non traitée) en cliquant sur " lancer test " dans le logiciel intégré de microscope ( Figure 2). Consigner les mesures pour 50 min. Remarque : pour le protocole actuel, un intervalle de temps de 5 s entre mesures servait. Après 50 min, arrêter l’enregistrement en cliquant sur " arrêter l’expérience " et retirer le puceron de la feuille. Enregistrer les mesures de fluorescence sous fichiers image (par exemple, tagged image file format, TIFF). Répéter l’expérience avec les autres paires de feuilles ; imagerie peut être étendu pour image 2 paires de feuilles à la fois, permettant l’imagerie simultanée des 2 génotypes. 5. Collecte de données Importer les fichiers image dans Fidji (Image J) et de les convertir à 32 bits en cliquant sur " Image " > " Type " > " 32 bits ; " ce qui permet la conversion des images en vidéos heatmap (voir étape 7). Jeter les échantillons dans lesquels les pucerons ne vous contentez pas au même endroit pendant plus de 5 min en regardant le mouvement insecte sous le microscope. NOTE : C’est souvent la majorité des échantillons, et jusqu’à 100 traitements peut-être devoir trouver 30 échantillons présentant la décantation réussie. Définir l’échelle de mesure de pixels (ou convertir en mm, si elle est connue) et le délai d’exécution pour le même intervalle de temps que celui utilisé au cours de la microscopie en cliquant sur " Image " > " propriétés. " L’aide du curseur, placer une région d’intérêt (ROI) autour de la zone de tissu pour analyse GFP. Remarque : Dans le protocole actuel, une circulaire ROI 50 pixels (0,65 mm) de diamètre a été utilisé en 3 endroits d’intérêt : les pucerons site (Fs), une région systémique sur la nervure de la feuille (Sm) et une région systémique adjacente à la nervure médiane (" latérales tissu " Sl) ( Figure 2). Créer le retour sur investissement en dessinant un ovale (utilisez le " outil ovale ") et modifier la taille à l’aide " modifier " > " sélection " > " spécifier. " Voir la Figure 2. Pour le contrôle non traité, sélectionnez ROIs dans des régions comparables de la feuille à ceux sélectionnés sur la feuille traitée (c’est-à-dire, la même région de la feuille comme où les pucerons se nourrissent la feuille traitée) ( Figure 2). figure 2 : analyse GCaMP3 Fluorescence sous le Microscope. Gauche : feuille de témoins non traités. A droite : feuilles imprégnées d’insecticide puceron. Le site de nutrition puceron est indiqué avec une pointe de flèche. Echelle = 1 mm. (A) image de champ lumineux. Grossissement : 7,8 X, se concentrer :-127,8330 mm, l’exposition : 1 s. (B) GFP image showing la ROIs utilisée pour l’analyse quantitative de la fluorescence. FS = site d’alimentation, Sm = nervure centrale systémique, Sl = tissu latéral systémique. Grossissement : 7,8 X, se concentrer :-127,8330 mm, l’exposition : 1 s. La GFP a été excitée à l’aide d’une lampe aux halogénures métalliques de 450 à 490 nm, et émission de fluorescence a été capturée entre 500 et 550 nm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. utiliser le plugin de temps analyseur de la série en cliquant sur " Plugins " > " analyseur série temps " pour analyser les valeurs brutes de fluorescence (F) dans le retour sur investissement au fil du temps. Ajouter le retour sur investissement d’intérêt (" Add [t] "). En vous assurant que le retour sur investissement est sélectionnée, sélectionnez " obtenir moyenne ; " Cela permet d’afficher un tableau de valeurs de F pour chaque trame à ce ROI. Copier ces données dans un tableur. Calculer l’aire du signal site alimentation en commençant par sélectionner la région en utilisant le " outil de sélection à main levée. " décrivent le signal maximal de GFP et ensuite calculer la surface de cette forme en cliquant sur " Analyze " > " mesure. " Calculer la vitesse du signal site alimentation en utilisant le plugin MTrackJ en cliquant sur " Plugins " > " suivi " > " MTrackJ. " cliquez sur le " Add " bouton et puis cliquez sur le curseur au centre de le signal lorsqu’il est tout d’abord visible. Cliquez à nouveau sur le bord du signal à son point le plus éloigné de la propagation. Cliquez sur " mesure " pour calculer la vitesse du signal. 6. Analyse des données définir le point de puceron s’installer en jouant à travers les cadres d’image du microscope à Fidji. NOTE : Le temps de régler est le cadre au cours de laquelle le puceron reste en un seul endroit pendant 5 min ou plus. La durée de la décantation des événements peut aussi être calculée à partir des images aux Fidji. Normaliser les données de F (ΔF/F) selon l’équation ΔF/F = (F – F, 0) / f 0, où F 0 est la fluorescence de la valeur de base moyenne calculée à partir de la moyenne de F sur les 60 premiers cadres de l’enregistrement avant le puceron s’installe. Répéter pour le témoin non traité. Tracer la fluorescence normalisée de la GFP (ΔF/F) au fil du temps pour ce ROI dans les feuilles traitées et non traitées. Jeter des échantillons (les deux feuilles) si le témoin indique forts Ca 2 + transitoires (p. ex., ΔF/F dépasse 0,2). Répéter jusqu’à ce qu’au moins 20-30 échantillons viables ont été analysés par génotype. 7. Création de vidéo de temps convertir l’image 32 bits des fichiers dans heatmaps en utilisant le plugin NucMed_Image lut en cliquant " Plugins " > " NucMed " > " Lookup tables. " dans le menu tables de recherche, sélectionnez " bleu vert rouge " pour convertir les images de cartes chaleur. Améliorer le contraste de la heatmap pour mettre en évidence la GFP a suscité le puceron des signaux à l’aide de " processus de " > " renforcer le contraste " > " ajuster pixels saturés %. " Ajouter des informations en temps en utilisant le plugin Stamper de temps en cliquant sur " Plugins " > " temps Stamper ". Définir la " heure de début " à " 0 " et la " intervalle " basé sur l’intervalle de temps utilisé pour la microscopie électronique (p. ex., 5 s). Exporter cette vidéo comme un audio-vidéo interleaved fichier (AVI). NOTE : Cette vidéo peut ensuite être éditée plus en détail dans d’autres logiciels (par exemple, Microsoft Movie Maker).

Representative Results

Figure 3 et Figure 4 sont représentant résulte d’une expérience en comparant une feuille imprégnées d’insecticide pucerons avec un témoin non traité. Une augmentation très localisée en fluorescence GFP sont visibles autour du site d’alimentation en quelques minutes dans la plupart des échantillons, alors que la Ca2 + dynamique dans le témoin non traité feuille séjour relativement stable (Figure 3 a et 3 b). Il est également possible d’observer une augmentation secondaire en fluorescence GFP après le pic initial dans certaines expériences (Figure 3 b). Jusqu’à 50 % de feuilles traitées, ne vous contentez pas les pucerons et les échantillons doivent être jetés. Des échantillons dans laquelle s’installer se produit, 27 % des échantillons ne présentent pas d’augmentations claires en fluorescence GFP autour du site d’alimentation (Figure 3 et tableau 1) ; par conséquent, 25-30 échantillons devraient en moyenne pour l’analyse quantitative. Visualisation de l’espace et la vitesse de l’élévation decyt site [Ca2 +] alimentation devraient révéler un signal d’environ 110 µm, se déplaçant à 6 µm/s (tableau 1). En outre, aucune élévation ducyt [Ca2 +] ne devrait être détectées systématiquement dans la feuille par traitement puceron, soit dans la nervure médiane systémique (Figure 4 a) ou les régions de tissus latéraux systémique (Figure 4 b). Un échantillon représentatif decyt dynamique [Ca2 +] au fil du temps est montré dans la vidéo 1. Il est également possible d’analyser le comportement de décantation de pucerons en déterminant le nombre et la durée des épreuves individuelles de décantation sous le microscope. Les résultats représentatifs pour ces comportements figurent au tableau 1, montrant que les pucerons prennent environ 10 min avant de s’installer, et quand ils ne règlent pas avec succès, cela dure pendant 20 min en moyenne. Par conséquent, les insectes sont installés dans un emplacement unique pour l’ensemble de l’élévation ducyt [Ca2 +]. Figure 3 : GCaMP3 peut être utilisé pour détecter les pucerons-induites de Ca2 + signaux sur le Site d’alimentation en feuilles détachées. Gauche : traces représentatives (n = 30) de fluorescence GFP normalisé (ΔF/F) autour du site d’alimentation d’une feuille de 35S::GCaMP3 . Les traces d’affichage 5 min avant de s’installer jusqu’à 25 min après décantation. Contrôle = emplacement équivalent sur une feuille non traités 35S::GCaMP3 . À droite : l’image stéréomicroscope représentatif ducyt élévation [Ca2 +] vue autour d’un site sur une feuille de 35S::GCaMP3 de pucerons. La fluorescence GFP est codé par couleur selon l’échelle de l’encart. L’id de pucerons décrit dans le blanc et le site d’alimentation indiqué avec une pointe de flèche. Grossissement : 7,8 X, se concentrer :-127,8330 mm, l’exposition : 1 s. La GFP a été excitée à l’aide d’une lampe aux halogénures métalliques de 450 à 490 nm, et l’émission de fluorescence a été capturée entre 500 et 550 nm. (A) un exemple d’un grand induits par les pucerons [Ca2 +]cyt élévation. (B) un exemple d’une moyenne induits par les pucerons [Ca2 +]cyt élévation. (C) un exemple d’aucune élévation decyt [Ca2 +] induits par les pucerons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Paramètre Moyenne (± SEM) [Ca2 +] élévation du cyt Pourcentage d’échantillons affichant une élévation ducyt [Ca2 +] 73 % Vitesse du front d’onde un 5,9 µm/s (± 0,6) Superficie maximale de propagation 110 µm2 (± 18) Comportement de pucerons Nombre de s’installe (> 5 min) 2 (± 0,1) Nombre total de s’installe (toutes durées) 3.8 (± 0,4) Temps s’installe pour imagerie b 20 min (± 2) Temps jusqu’au premier settle c 11 min (± 1,4) Pourcentage du temps total passé réglé 62 % (± 3) Tableau 1 : [Ca2 +]cyt élévation et paramètres de comportement de pucerons pendant 35S::GCaMP3 Imaging. Paramètres calculés à partir des échantillons viables dans les règlements de > 5 min s’est produite. (A) Vitesse du signal visible depuis le point d’initiation au point plus éloigné de la propagation. (B) durée des événements décantation initiales utilisée pour l’analyse de la fluorescence. (C) durée de la période entre le début de l’imagerie et le puceron de la première s’installer. [Ca2 +] données d’élévation du cyt antérieurement transmises à la cellule végétale (état actuel : initiales QC). Figure 4 : GCaMP3 ne peut pas détecter des signaux2 + Ca a suscité le puceron systémiques pour le Site d’alimentation. Traces représentatives (n = 30) de fluorescence GFP normalisé (ΔF/F) dans des endroits systémiques pour le site en pucerons feuilles de 35S::GCaMP3. Les traces d’affichage 5 min avant de s’installer jusqu’à 25 min après décantation. Contrôle = emplacement équivalent sur une feuille non traités 35S::GCaMP3 . (A) ΔF/F, dans la région de la nervure médiane systémique. (B) ΔF/F, dans la région de tissu latéral systémique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 1 vidéo : floraison de GCaMP3 dans le temps comme un se nourrit de pucerons. La fluorescence GFP est codé par couleur selon l’échelle de l’encart. L’emplacement du site d’alimentation du puceron est indiquée par une flèche. Gauche : feuille de 35S::GCaMP3 exposé à un adulte de M. persicae . A droite : Une 35S::GCaMP3 contre les pucerons-non feuille. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

La méthode décrite dans cet article permet l’analyse en temps réel de plante Ca2 + signalisation lors d’un stress biotique tels que l’alimentation insectes. Il démontre qu’une des premières réponses plante de telles menaces est une localisé [Ca2 +]cyt altitude autour du site d’alimentation de l’insecte. Grâce à l’utilisation de mutants, cette méthode permettra la la caractérisation moléculaire et physiologique de ces signaux, qui n’était pas possible auparavant. Une étape cruciale dans le présent protocole est de veiller à ce que les feuilles séparées ne sont pas trop dérangés pendant le processus de détachement (étape 3.2) ou lors du transfert des insectes sur les feuilles (étape 4.5). Étant donné que le protocole actuel offre une mesure relative de [Ca2 +]cyt plutôt qu’une concentration absolue, il est essentiel que les paramètres de microscope restent constantes tout au long de l’expérience. Il y a aussi la possibilité de partialité humaine lors de la sélection des rapports et l’analyse des données, et à ce titre, il est recommandé que les expériences sont effectuées en double-aveugle.

Il y a plusieurs avantages importants de mesure [Ca2 +]cyt durant le stress biotique avec ce protocole. Tout d’abord, l’utilisation d’un fluorophore seul avec un haut rendement fluorescent permet l’imagerie se fasse sur un stéréomicroscope, qui est moins coûteux que l’utilisation d’un microscope confocal. L’utilisation d’un fluorophore seul aussi simplifie la collecte de données et l’analyse, car il n’y a qu’une mesure d’enregistrer. En outre, l’utilisation d’un stéréomicroscope permet l’imagerie des feuilles entières, qui est essentiel, étant donné que de nombreuses interactions biotiques, y compris les interactions plantes-pucerons, se produisent sur une grande échelle spatiale. La haute résolution temporelle d’image capture possible avec GCaMP3, basé sur la dissociation rapide de Ca2 + de la sonde après liaison23,30 et le haut rendement fluorescent, permet pour les mesures à prendre jusqu’à toutes les 5 s. En outre, l’analyse foliaire empêche la fuite de l’insecte, une clé limitant pas à mener de telles expériences sur les plantes entières (en préparation). Les feuilles séparées aussi veiller à ce que l’insecte se nourrit d’un emplacement prédéfini, permettant l’analyse de Ca2 + dynamique avant, pendant et après la tétée. Ce protocole s’assure également que les feuilles des stades de développement similaires sont utilisées pour analyse.

Le principal inconvénient de ce protocole provient de l’utilisation d’un biocapteur non-ratiométrique. Avec single-FP biocapteurs, variation des émissions de GFP peut résulter de variables expérimentales que [Ca2 +]cyt, tels que les changements de pH cellulaire, mouvement ou le niveau d’expression du biocapteur. Ces questions ne sont pas rencontrées avec frette Cameleons au cours de la frette, comme le transfert d’énergie de PCP à YFP se produit uniquement sur la liaison du Ca2 + . Autres conditions qui modifient les propriétés fluorescentes des fluorophores individuels sont peu susceptibles d’imiter les changements défavorables dans l’intensité de la PCP et YFP, et le calcul ratiométrique utilisé par nature normalise les mesures pour bon nombre de ces autres artefacts optiques23,30. Ce qui rend les estimations de l’absolu [Ca2 +]cyt plus fiable avec Cameleons frette. Par conséquent, GCaMP3 mieux sert un biocapteur mesure relative [Ca2 +]cyt, même s’il est encore suffisante pour détecter et caractériser les phénomènes biologiques en plantes5,(in preparation). Par conséquent, il est indispensable d’utiliser des contrôles pour montrer que l’effet observé est en raison de Ca2 +, y compris Ca2 +-liés mutants génétiques(en préparation) ou Ca2 + canal inhibiteurs pharmacologiques telles que La3 + . Ce qui est important, single-FP biocapteurs affichent habituellement un meilleur rendement fluorescent et la plus grande gamme dynamique (c’est-à-dire, une augmentation de fluorescence à la fixation de Ca2 + ) de FRET Cameleons23, qui rend GCaMP plus adapté à imagerie au niveau du tissu, tandis que le FRET Cameleons sont un outil utile pour l’imagerie cellulaire avec un microscope confocal5,25.

Pendant l’exécution du présent protocole, il est possible que certains problèmes surgiront nécessitant un dépannage. Par exemple, il est recommandé que les échantillons dans lesquels les affichages feuille de contrôle (non traitée) grandes [Ca2 +]cyt élévations sont mis au rebut (étape 6.3). Ces transitoires sont probablement le résultat du stress induit par la microscopie. En effet, la lumière bleue est connue pour provoquer Ca2 + signaux38,39,40,41, et la lumière intense peut entraîner aussi la température et le stress osmotique, qui aussi susciter [Ca2 +]cyt élévations21,25,42. Par conséquent, pour réduire ces contraintes, il est important de faire l’expérience dans une pièce bien aérée et température contrôlée et d’éviter inutilement longs temps d’exposition. Il est également important de ne pas perturber les feuilles trop pendant le détachement ou la microscopie pour empêcher touch-induites [Ca2 +]cyt élévations43,44,45. Questions peuvent également être rencontrées de régler les insectes. Avec M. persicae, ne vous contentez pas les insectes sur les feuilles dans plusieurs échantillons. Cela pourrait être le résultat de la défense a suscité la plaie dans les feuilles détachées46,47, ou la perturbation des insectes par la lumière bleue. En effet, la vision de M. persicae est régie par trois photorécepteurs, dont une avec une sensibilité maximale de 490 nm48. Réduire l’exposition de la microscopie et manipulation les pucerons avec soin peuvent réduire la détresse et encourager à s’installer.

Le protocole décrit dans le document donne de nouvelles perspectives sur la compréhension moléculaire des interactions plantes-insectes et la réponse des plantes aux stress biotiques. Il permet la visualisation de l’une des premières réponses plante à l’alimentation des insectes et facilite encore enquêtes grâce à l’utilisation de considérables ressources génétiques Arabidopsis disponibles. En outre, ce protocole permet l’utilisation d’organismes vivants, par opposition aux extraits de49 ou éliciteurs50. À l’avenir, cette technique pourrait être appliquée aux autres contraintes biotiques, comme les autres espèces d’insectes, nématodes ou agents microbiens pathogènes, ainsi qu’aux stress abiotiques. La microscopie de GCaMP3 peut également être modifiée pour autres tissus végétaux, autres ROIs sur la feuille, même plantes entières ou d’image. En outre, il y a le potentiel pour le biocapteur à être génétiquely encodée en espèces végétales supplémentaires. Par conséquent, le protocole décrit dans le présent document a le potentiel d’infiltration la base moléculaire de Ca2 + signalisation dans une gamme de nouvelles interactions biotiques entre les plantes et autres espèces.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) pour les conseils concernant la microscopie. Les auteurs souhaitent également remercier le John Innes Centre horticole et les départements d’entomologie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation John de Innes (T.V.), bourse B/JJ004561/1 le BBSRC et le John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. et D.S.), une année dans le placement de l’industrie de la John Innes Centre (M.A.) , une bourse d’été de la Biochemical Society du Royaume-Uni (J.C.), JST PRESTO (M.T.) et subventions 1329723 MCB et IOS-1557899 de la National Science Foundation (M.T. et S.G.).

Materials

35S::GCaMP3 Arabidopsis John Innes Centre/Universty of Wisconsin – Step 1.1
100 mm2 square plastic plates R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water – For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis – – For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer) clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn – Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2 Hobbycraft 610101 To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate ThermoFisher Scientific 2101 To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil Wrap Film Systems, Telford, UK 26B06 To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap SC Johnson & Son, Racine, WI, USA To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope Leica Microsystems – For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0 Leica Microsystems Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a National Institutes of Health, USA) – For image analysis (Step 6.1)
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Vincent, T. R., Canham, J., Toyota, M., Avramova, M., Mugford, S. T., Gilroy, S., Miller, A. J., Hogenhout, S., Sanders, D. Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor. J. Vis. Exp. (126), e56142, doi:10.3791/56142 (2017).
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