概要

作成し、ディスカッションと多様なグループの蛋白質の分類を容易にする参照を適用します。

Published: August 16, 2017
doi:

概要

このプロトコルの目的は、首尾一貫した命名と分類基準に欠けているグループの発散の蛋白質のための参照を開発します。このリファレンスでは、分析と全体としてグループの議論を促進し、設立名に加えて、使用することができます。

Abstract

さまざまな生物を使用して別のラボで研究されている関連タンパク質は全体としてグループを議論して、適切なコンテキストに新しいシーケンスを配置する困難の命名と分類、統一システムに欠けるかもしれない。構造に関連する重要なシーケンス機能を優先する参照の開発および/または蛋白質の多様なグループにいくつかの一貫性を追加する確立された名前に加えてアクティビティを使用できます。本稿は表示方法表計算ソフトで生成された参照することができます既存のタンパク質スーパーファミリーの間の関係を明らかにするだけでなく新しいの追加を容易にするため例としてシステイン安定化 α-ヘリックス (CS αβ) スーパーファミリーを使用します。シーケンス。それはまた参照が系統解析の妥当性に影響を与える一般的に使用されるソフトウェアで生成された配列アラインメントを絞り込むに役立つかを示しています。参照の使用は、分子解析によって適切にキャプチャされない機能を備えた、イチイの広いスペクトルからの高度に分岐のシーケンスを含む蛋白質のグループの最も役に立つでしょう。

Introduction

特性および他の蛋白質との関係は、タンパク質の名前を反映すべき。残念ながら、名が発見の時に一般に割り当てられ、研究し続けており、大きな文脈の理解を変更可能性があります。タンパク質が独立して以上 1 つのラボ、命名やと思われる名前を割り当てるときに決定的な特性変更してもはや十分に蛋白質を区別する名前によって識別された場合、これは複数名につながることができます。他から。

無脊椎動物のディフェンシンは、変性専門語および分類の良い例を提供します。最初の無脊椎動物のディフェンシンは、昆虫から報告された、哺乳類ディフェンシン1,2知覚の相同性に基づいて提案された、名前「昆虫ディフェンシン”。用語のディフェンシンはまだ使用されて、その無脊椎動物、哺乳類のディフェンシンは、共通祖先3,4を共有しないにもかかわらず、明らかになった。種に応じて「ディフェンシン」無脊椎動物は六つまたは 8 つのシステイン (3 つまたは 4 つのジスルフィド結合となる) とさまざまな抗菌活性があります。線虫 remanei5から最近同定された cremycins などの状況、同じ特性を持つ蛋白質を複雑にディフェンシンは常に「ディフェンシン、」呼び出されませんよう。さらに、無脊椎動物の大きいディフェンシンは脊椎動物 β-ディフェンシンより他の無脊椎動物のディフェンシン6に関連する進化する可能性が高い。それにもかかわらず、研究者は時々、名前「ディフェンシン」どのシーケンスは、解析に含めるかを決定するときに依存します。

構造研究は、昆虫のディフェンシンとサソリ毒素7間の類似性を明らかにし、CS αβ 倍その後昆虫ディフェンシン8の構造特性を定義として設立されました。この倍は現在 5 つの家族が含まれています、タンパク質構造分類 (SCOP) データベース9でサソリ毒素のような (CS αβ) スーパーファミリーを定義します: 昆虫ディフェンシン、短鎖サソリ毒素、長鎖サソリ毒素MGD-1 (軟体動物) からと植物のディフェンシン。このスーパーファミリーは、最近は、cis ディフェンシン4とキャス/遺伝子 3 D データベース10113.30.30.10 スーパーファミリーと同義です。様々 な無脊椎動物の分類、植物および菌類をこの倍を含んでいる蛋白質の名前が明確にはシステイン番号または接合パターン、抗菌活性、進化の歴史12に関連しないことから研究。

一貫性と明確な基準の欠如を名前を付け、このスーパーファミリーで新たに確認されたシーケンスの分類を困難に作る。このスーパーファミリー蛋白質を比較することに大きな障害となってシステインはそれぞれ個々 のシーケンスに対して (各シーケンスで最初のシステインは C1)、構造の役割を考慮する方法がないと番号が付けられます。これはシステインの同じ番号を持つシーケンスだけを比較できることを意味します。アラインメントと系統解析を難しくした CS αβ 折りを形成システイン以外ほとんどシーケンス保全がありません。構造的特徴を優先番号システムを開発することによってスーパーファミリー シーケンスことができますより簡単に比較して、整列します。保存機能だけでなく、これらのサブグループを定義するが、すぐに視覚化できることし、適切なコンテキストに新しいシーケンスをより簡単に配置できます。

本稿は、番号 CS αβ スーパーファミリーのシステム参照を生成する表計算ソフト (たとえばExcel) を使用します。それはこのシーケンスの比較を明確にしクマムシから識別される新しい CS αβ シーケンスに適用されますを示します。興味のシーケンスを使用する場合は、ガイダンスを提供するプロトコルを書かれた CS αβ スーパーファミリーを例として使用して、しかし、それはこのスーパーファミリーまたはシステイン豊富なシーケンスに固有するものではありません。このメソッドは、異なる分類群で独立して研究されているおよび/または分子解析ソフトウェアによって容易に認識されないことが離散特性を持つほとんどの全体的な相同タンパク質のグループに最も役に立つでしょう。されますので、限られたユーティリティの重要な機能は特定されていない場合、このメソッドは、重要な機能に関するいくつかの事前の意思決定を必要とします。主な目的は、順序関係の簡単な可視化を実現する方法を示すことです。これは、解析、配列アラインメントを通知する使用できますが、バーコード メソッドがオートメーション13のより多くの容量を持つ適切な代替になる配置と分析は主目標である場合。現在のメソッドは、3 D 構造の直接的可視化に役立つされませんので線形形式で各ペプチドの機能を表示します。

Protocol

1 です。 興味の蛋白質群を定義する機能を決定する グループの一部と見なされるために必要な機能に関する合意がある場合を決定する相談以前の出版物。不一致や研究グループ間の意見の違いのメモを取るし、別の 1 つのサブグループを区別するために役立つ可能性がある特徴があります。 以前文献で定義する特性が解決されない場合は、保存機能を識別するための出発点?…

Representative Results

文献で報告された CS αβ スーパーファミリーのシーケンスのグループは、図 4のとおりです。各シーケンスの番号付けに基づいてシステインの組み合わせは、5 つの基本的なグループ (表 1、中央の列) をお勧めします。グループ 1 は 6 システイン 3 二硫化から債券、昆虫、クモ、軟体動物、線虫、菌類からのシーケンスが含まれてい?…

Discussion

グループ内でのタンパク質の命名基準は明確にする必要がありますが、これは常にそうではありません。フォールド CS αβ のシーケンスは、様々 な生物を使用して命名法の異なるシステムの結果し同様、特性のレベルを変化させる多くのラボで研究されている.完全に新しい命名法を課すしようとすると、妥当ではないと以前の文学をコンサルティングするとき大いに混乱になります。スー?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

継続的な tardigrade 抗菌ペプチドの研究は、中西部大学研究事務所主催プログラム (ORSP) から学内資金によってサポートされます。ORSP、研究デザイン、データ収集、分析、解釈、または原稿を準備する役割がなかった。

Materials

BLAST webpage https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite) DNASTAR https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013 Microsoft
FigTree  http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA www.megasoftware.net
MrBayes http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/

参考文献

  1. Matsuyama, K., Natori, S. Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina. J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).
  2. Lambert, J., et al. Insect immunity: Isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae. of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides. PNAS. 86 (262-266), (1989).
  3. Dimarcq, J. -. L., Bulet, P., Hetru, C., Hoffmann, J. Cysteine-rich antimicrobial peptides in invertebrates. Biopolymers. 47, 465-477 (1998).
  4. Shafee, T. M. A., Lay, F. T., Hulett, M. D., Anderson, M. A. The Defensins Consist of Two Independent, Convergent Protein Superfamilies. Mol Biol Evol. 33 (9), 2345-2356 (2016).
  5. Zhu, S., Gao, B. Nematode-derived drosomycin-type antifungal peptdies provide evidence for plant-to-ecdysozoan horizontal transfer of a disease resistance gene. Nat Commun. 5, (2014).
  6. Zhu, S., Gao, B. Evolutionary origin of b-defensins. Dev. Comp. Immunol. 39, 79-84 (2013).
  7. Bonmatin, J. -. M., et al. Two-dimensional 1H NMR study of recombinant insect defensin A in water: Resonance assignments, secondary structure and global folding. J Biomol NMR. 2 (3), 235-256 (1992).
  8. Cornet, B., et al. Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A. Structure. 3 (5), 435-448 (1995).
  9. Murzin, A. G., Brenner, S. E., Hubbard, T., Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigations of sequences and structures. J Mol Biol. 247, 536-540 (1995).
  10. Sillitoe, I., et al. CATH: comprehensive structural and functional annotations for genome sequences. Nucleic Acids Res. 43, 376-381 (2015).
  11. Lam, S. D., et al. Gene3D: expanding the utility of domain assignments. Nucleic Acids Res. 44, 404-409 (2016).
  12. Tarr, D. E. K. Establishing a reference array for the CS-ab superfamily of defensive peptides. BMC Res Notes. 9, 490 (2016).
  13. Shafee, T. M. A., Robinson, A. J., van der Weerden, N., Anderson, M. A. Structural homology guided alignment of cysteine rich proteins. SpringerPlus. 5 (27), (2016).
  14. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  15. Duckert, P., Brunak, S., Blom, N. Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein Eng Des Sel. 17 (1), 107-112 (2004).
  16. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Methods. 8, 785-786 (2011).
  17. Kobayashi, Y., et al. The cysteine-stabilized a-helix: A common structural motif of ion-channel blocking neurotoxic peptides. Biopolymers. 31, 1213-1220 (1991).
  18. Gao, B., del Carmen Rodriguez, M., Lanz-Mendoza, H., Zhu, S. AdDLP, a bacterial defensin-like peptide, exhibits anti-Plasmodium. activity. Biochem Biophys Res Commun. 387, 393-398 (2009).
  19. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  20. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  21. Ronquist, F., Huelsenbeck, J. P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. バイオインフォマティクス. 19 (12), 1572-1574 (2003).
  22. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  23. Zhang, Z., et al. Protein sequence similarity searches using patterns as seeds. Nucleic Acids Res. 26 (17), 3986-3990 (1998).

Play Video

記事を引用
Tarr, D. E. K. Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group. J. Vis. Exp. (126), e56107, doi:10.3791/56107 (2017).

View Video